首乌药材的HPLC指纹图谱研究
刘 旭，徐江平，游文玮，杨雪梅*(南方医科大学药学院，广东 广州 510515)

摘要：目的：建立首乌药材的HPLC指纹图谱，考察不同产地首乌的药材质量。方法：采用液相色谱法，建立首乌药材的指纹图谱，流动相为乙腈-水梯度洗脱，检测波长为254nm?结果：建立的指纹图谱共确定了七个共有峰，结果稳定，重复性好? 结论：用该方法建立首乌药材的指纹图谱，对首乌药材的质量控制是可行的?
关键词 首乌；指纹图谱；高效液相色谱法

Study on Fingerprint of Radix Polygoni Multiflori by high-performance liquid chromatography
LIU Xu, XU Jiang-ping, YOU Wen-wei, YANG Xue-mei*

School of Pharmacy, Southern Medical University; Guangzhou 510515
ABSTRACT: OBJECTIVE: To investigate the quality of Radix Polygoni Multiflori from different growing areas. METHODS: HPLC method was used to establish the fingerprint of Radix Polygoni Multiflori, with a mixture of CH3CN-H2O as the mobile phase, with a wavelength at 254nm. RESULTS: The HPLC fingerprints of Radix Polygoni Multiflori has been established. The result is stable. CONCLUSION: The fingerprint can be used for quality control of Radix Polygoni Multiflori.
KEY WORDS: Radix Polygoni Multiflori; Fingerprint; HPLC

　　何首乌(Radix Polygoni Multiflori)是蓼科植物何首乌(Polygonum multiflorum)的干燥块根，主产河南、广东、贵州、湖北、江西等地。何首乌的主要有效成分是蒽醌类、羟芪衍生物(以二苯乙烯苷含量最高)及磷脂类等。临床上分生首乌和制首乌两种饮片，生首乌苦、甘、涩、温，归肝、心、肾经，有解毒、消润肠通便等功效。生首乌经炮制成制首乌后，平性转温、苦味转甘，补肝肾，益精血，乌须发，强筋骨[1]。本实验旨在研究何首乌药材的指纹图谱，同时也对不同产地首乌药材的质量做了考察。

1 仪器和试药
　　美国Agilent1100高效液相色谱仪；电子分析天平(上海第二天平仪器厂MA110型)。二苯乙烯苷标准品(批号为0844-200003)购自中国药品生物制品检定所；首乌药材由解放军第二军医大学药学院生药教研室鉴定；乙腈、甲醇(色谱纯，Merck KGaA，64271 Darmstadt，Germany)。
2 方法与结果
2.1色谱条件
　　色谱柱：Agilent Hypersil (250mm×4.6mm，5μm)C18柱；流动相：乙腈－水（10：90（15min）→20：80（35min）→30：70（45min）→80：20 v/v）；流速：1mL/min；柱温：30℃；检测波长：254nm。
2.2检测波长的选择
　　本实验采用二极管阵列检测器，在分析时进行全波长紫外扫描，并在不同波长下获取数据，经比较后表明254nm色谱图峰形最好，出峰数目适中，各色谱峰相互之间分离度较好，故检测波长定为254nm。
2.3 HPLC供试品溶液的制备
　　精密称取首乌药材粗粉(40目)1g，75%甲醇10ml超声提取20min(2次)，滤过，合并浓缩滤液，用甲醇定容至10ml，过0.45μm微孔滤膜，即得；另精密称取对照品1mg左右，置25ml容量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度摇匀得对照品溶液（避光保存）；上述样品备HPLC分析使用。
2.4测定指纹图谱的方法考察
　　精密吸取供试品溶液20μl，注入HPLC仪，按2.1项下色谱条件测试，记录60min色谱图。
2.4.1精密度实验
　　精密吸取首乌供试品溶液，连续进样5次，测定HPLC色谱图，结果各共有峰相对峰面积的RSD均小于1.61%，相对保留时间的RSD均小于0.75 %，仪器精密度良好。
2.4.2稳定性实验
　　精密吸取同一批药材制备的供试品溶液，分别在放置0， 2， 4，8，12, 24h后测定指纹图谱， 结果各共有峰相对峰面积的RSD均小于2.02%，相对保留时间的RSD均小于0.93%，表明样品在24 h内稳定性良好。
2.4.3重现性实验
　　平行操作制备5份首乌供试品溶液，测定HPLC色谱图，结果各共有峰相对峰面积的RSD均小于2.68%，相对保留时间的RSD均小于1.26%，方法重现性良好。
2.5指纹图谱的测定及技术参数
2.5.1指纹图谱的测定
　　取6批不同产地来源的首乌供试样品，按2.1项下条件进行HPLC分析，实现了峰与峰之间的良好分离，确定了7个共有峰(图1)。

2.5.2参照物的选择
　　在HPLC图谱中选择峰面积较大、出峰时间适中且稳定的色谱峰作为参照峰[2]，结果14 .7 min的色谱峰符合此条件，经对照品对照确定为二苯乙烯苷的吸收峰，且二苯乙烯苷为首乌的主要活性成分之一，故选择二苯乙烯苷作为参照物（s）。
2.5.3共有峰的相对保留时间
　　相对峰面积指纹图谱相似度计算选取色谱图中的7强峰，由色谱工作站辅助自动进行峰匹配，确定7个共有峰。以二苯乙烯苷色谱峰的保留时间和峰面积积分值为1，各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均在3%以内，结果见表1和表2。

3 讨论
　　中药化学成分的多样性与复杂性是其发挥疗效的物质基础，也是质量评价的难点与重点。目前，大量中药在其有效成分尚未被阐明的情况下，只采用单一或少数几个成分做指标进行质量评价，往往不能全面反映其质量情况。目前能较客观反映复杂体系中化学成分全貌的指纹图谱，是唯一获得国际认可的中药质量控制技术，正得到普遍重视[3]。在原药材GAP生产基础上，建立中药材、中成药指纹图谱的全面质量控制，必将成为中药质量评价的发展趋势，在中药质量控制领域有广阔的应用前景[4]。本实验建立了首乌药材HPLC指纹图谱，确定了7个共有峰，其相对保留时间及相对峰面积的RSD均在3%以内，在此基础上确认了各共有峰的归属；计算了指纹图谱的相似度，结果均在0.99以上，上述结果表明所建立的指纹图谱的技术指标稳定，重现性好。本实验结果能使首乌药材中尚不明确的众多成分由无序到有序，使各成分的来源明晰，并依其相对保留时间和相对峰面积等参数来客观地评价了药材的内在质量。

参考文献
[1] 鲁静，粟晓黎．高效液相色谱法测定何首乌及制首乌中羟芪衍生物的含量[J]．药物分析杂志，2000，20(2)：104
[2] Rao C, Zhou B H, Lei J C, et al．Finger print technique of the traditional Chinese medicine and it's application [J]．Herald of Medicine ,2005,24 (3):218
[3] Huang S, Gu L, Huang H Z, et al．Studies on finger print of the traditional Chinese medicine[J]．The Journal of Pharmaceutical Practice, 2003 ,21(6):326
[4] 何文斐，李士敏．中药色谱指纹图谱的研究进展[J]．时珍国医国药，2003，14(4)：238