扑尔敏作为手性固定相表征试剂的探讨

丁广辉，耿利娜，罗爱芹＊，马宁
（北京理工大学　生命科学与技术学院，北京100081）
车宝泉
（北京药检所，北京100044）

　　摘要：用合成的乙酰化环糊精手性色谱柱和C－18柱分别在pH 4.0和中性条件下分离扑尔敏。扑尔敏结晶粉末用于表征手性固定相分离能力时，在酸性流动相中分解为马来酸和氯苯那敏。扑尔敏作为手性固定相表征试剂时，要排除马来酸的干扰，检测波长定在260.5nm，此处为氯苯那敏对映异构体最大吸收波长。
　　关键词：扑尔敏 手性固定相 表征 手性分离 氯苯那敏

1引言
　　手性药物分离与制备单一对映体一直是药理学研究和制药领域的研究热点,也是技术难点[1-3]。近年来，研究人员合成了大量新型手性固定相用于气相色谱、毛细管电泳和液相色谱分离分析研究；在评价手性固定相的手性拆分能力时，扑尔敏是最常用的表征试剂 [4-5]。
　　扑尔敏，又称马来酸氯苯那敏，学名马来酸氯苯吡胺,分子式:C16H19ClN?C4H4O4 (390.87)，结构如图1，为白色结晶粉末,易溶于水,乙醇和氯仿，水溶液成酸性。氯苯那敏游离碱为油状物,马来酸（丁烯二酸）酸性较强,与之成盐,为白色结晶粉末,熔点为132～135℃。马来酸紫外最大吸收波长在200nm以下，氯苯那敏最大吸收波长在260.5nm.
扑尔敏用于表征气相色谱手性固定相时，气化温度在熔点之上，扑尔敏气化但不会分解出马来酸和氯苯那敏两部分；因此在表征气相色谱手性固定相分离能力时，出现扑尔敏对映异构体两个峰并且两物质最大吸收都在260.5nm时，就可初步断定对映异构体已经分离。
　　扑尔敏用于表征毛细管电泳和液相色谱手性固定相，流动相为酸性时分解为马来酸和氯苯那敏两部分。一些文献中用扑尔敏表征毛细管电泳手性固定相时，把检测波长简单地定在210nm处，出现两个峰即认为扑尔敏对映异构体得到分离时不正确的，因为可能两峰其中一个为马来酸，对映异构体并未得到分离。

 2实验与讨论
2．1 仪器与试剂
　　Angilent Series1100 LC-MSD TRAP液质联用仪； Waters515-717-996 HPLC系统，包括515二元泵，717自动进样器，996二极管阵列检测器，Milliennium32色谱工作站。
　　C-18柱（150×4.6mm,ChromasilR），乙酰化环糊精手性柱（150×4.6mm，本实验室合成、装填）。
　　扑尔敏（结晶粉末，北京市药检所提供）。
2．2扑尔敏在乙酰化环糊精手性柱上的分离
　　实验条件：流动相：甲醇/磷酸缓冲盐溶液＝1:1（0.033mol/L磷酸缓冲盐溶液调节pH=4）,流速:1mL/min，进样时间:25min，进样体积:10μL，检测波长:200－400nm全波长扫描
　　提取紫外210nm下色谱图,得到图2，光谱指数图显示第一个峰物质的最大吸收是260.5nm,第二个峰物质的最大吸收在200nm以下。如果简单地把检测波长定在210nm处，从色谱图中两个峰得出对映异构体分离的结论是错误的；用二极管阵列检测器全波长扫描，从光谱指数图可以判断，峰1是氯苯那敏，峰2是马来酸，对映异构体没有得到分离。
提取紫外260nm下色谱图,如图3所示，峰1氯苯那敏在紫外260nm 处吸收明显大于马来酸，验证手性异构体没有得到分离。而我们用乙酰化环糊精手性柱分离亚叶酸钙对应异构体，分离度为0.8；尼莫地平在这根手性柱上的分离度为1.0。

 2．3 在C－18柱上的分离扑尔敏
　　实验条件：Waters515-717-996 HPLC系统,流动相：甲醇/磷酸盐缓冲溶液=1:1，流速:1mL/min，进样体积:10μL，检测波长:200－400nm全扫描。色谱柱为C－18柱（150×4.6mm,ChromasilR）
提取紫外210nm下色谱图，得到图4，样品扑尔敏在C－18柱上分离出现两个峰，第一个出峰的是马来酸，第二个为氯苯那敏。流动相加了磷酸盐缓冲液，手性药物纯品对映异构体不可能在C－18柱上被拆分，出现两个峰的原因是样品在加入酸性流动相后水解为马来酸和氯苯那敏。
3．4 液质联用鉴定扑尔敏

　　实验条件：Angilent Series1100 LC-MSD TRAP液质联用,流动相：甲醇/水=1:1，流速:1mL/min，进样体积:10μL，检测波长:220nm
色谱柱为C－18柱（150×4.6mm,ChromasilR）。
色谱图上出现一个峰，表明扑尔敏在接近中性的流动相中没有分解。
质谱检测到最大吸收峰处分子量为114.8,为马来酸的分子量。

4结论

     扑尔敏在接近中性流动相中不分解，在酸性流动相中分解为马来酸和氯苯那敏两部分；扑尔敏结晶粉末用于表征手性固定相的手性拆分能力时，要排除马来酸的干扰，不能因色谱图出现两个峰接断定对映异构体得到分离。检测波长应定在260.5nm，此处为氯苯那敏最大吸收波长，而不应该是很多文献中出现的210nm。

[1]Mikael Hedeland.Journal of Chromatography B, 804 (2004) 303–311
[2]Yei-Shung Wang, Kok-Thong Tai. Ecotoxicology and Environmental Safety 57 (2004) 346–353
[3]Igor Locatelli, Vojko Kmetec. Journal of Chromatography B, 818 (2005) 191–198
[4]L.J. Jin , S.F.Y. Li，Journal of Chromatography B, 708 (1998) 257–266
[5]H. Makamba，Journal of Chromatography A, 818 (1998) 43–52

Trial of Evaluating the Chiral Stationary Phase by Separating Chlortrimeton Isomers

Ding guanghui, Geng Lina, Luo Aiqin, Ma Ning
(Beijing Institute of Technology ,School of Life Science and Technology ,100081 )
Che Baoquan
(Beijing Istitute of Medicine Test,100044 )

Abstract: Chlortrimeton isomers is Separated with acetyl derivated β–CD chiral column and normal C-18 column,under pH4.0 and neural enviorment. It is validated that Chlortrimeton decomposes to two parts: Chlorpheniramine and Maleate under the acidic mobil phase。Detection wavelength is suggested to be fixed at 260.5 nm,where Chlorpheniramine gets the greatest absorbance.
Keywords : Chlortrimeton; Chiral stationary phase; Evaluation;Enantiomer separation; Chlorpheniramine