色谱法鉴定过亚硝酸根诱导苯并[a]芘代谢的产物
 

色谱法鉴定过亚硝酸根诱导苯并[a]芘代谢的产物
林太凤1,罗云敬* ,甄 岩2,孙志成1,钟儒刚1
(1.北京工业大学生命科学与生物工程学院 北京 100022;
2北京工业大学环境与能源工程学院 北京 100022)

摘要:以卟啉为细胞色素P450的模拟生物酶、过亚硝酸根为氧化剂,首次建立卟啉/过亚硝酸根化学模拟系统,并用这种系统研究了苯并[a]芘的代谢活化。采用HPLC手段比较了四(对-氯苯基)卟啉氯化铁(p-ClFeTPPCl)和四(五氟代苯基)卟啉氯化铁(Fe(F5P)Cl)对苯并[a]芘代谢作用,发现p-ClFeTPPCl/过亚硝酸根组成的系统作用较好。采用HPLC法对苯并[a]芘在p-ClFeTPPCl/过亚硝酸根模拟系统中发生代谢的产物进行了分析鉴定,已经基本确定了两种代谢产物(1种二氢二醇,1种二醌产物)。这一结果表明,体内存在的过亚硝酸根能诱导苯并[a]芘的代谢活化,过亚硝酸根和卟啉组成的模拟系统可以用于苯并[a]芘的代谢研究。
关键词:色谱法;过亚硝酸根;苯并[a]芘;代谢

        自从90年代发现过亚硝酸根(简称:ONOO-)是存在于生物系统中的活性极强的氧化剂,各国学者都侧重研究过亚硝酸根对生物分子如蛋白质、DNA、脂质[1]等的损伤及其作用机理。最近报道了过亚硝酸根与化学致癌物如苯、多环芳烃等在体内的致变、致癌作用有潜在的联系[2-3]。过亚硝酸根在化学致癌物的致变和致癌过程中起着何种作用,目前尚未清楚。鉴于过亚硝酸根极强的氧化能力,我们猜测过亚硝酸根可能氧化苯、多环芳烃等化学致癌物,从而诱导了这些致癌物的代谢。
苯并[a]芘(B[a]P)是一种人们日常生活中接触最多的强致癌性多环芳烃,常被作为研究多环芳烃的代表。苯并[a]芘代谢及其致突变的研究虽然比较成熟,但主要是在微粒体或细胞色素P450的催化下进行的,以仿生酶来研究B[a]P的毒理性质则进展缓慢。新近报道了以卟啉/氧化剂为细胞色素P450模拟系统研究化学致癌物对细菌的致变作用[4-5]。本文建立了卟啉/ONOO-模拟代谢系统,首次以此系统研究过亚硝酸根对苯并[a]芘代谢的诱导作用。采用HPLC对过亚硝酸根诱导苯并[a]芘代谢的产物进行分析和鉴定,进而阐明过亚硝酸根在苯并[a]芘代谢中的诱导作用。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂
主要仪器:紫外分光光度计(日立U-3010),Waters 色谱系统(Waters 600 高效液相泵,Waters 2487紫外检测器,Millennium32色谱工作站);Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250mm, 5μm),ZDF-6090真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)。
主要试剂:四(对-氯苯基)卟啉氯化铁(p-ClFeTPPCl)由佘远斌教授提供;四(五氟代苯基)卟啉氯化铁、苯并[a]芘购于sigma公司;标准样品(3-羟基-苯并[a]芘,苯并[a]芘-9,10-二氢-9,10-二醇,苯并[a]芘-3,6-二醌)由美国国家癌症研究所提供;过亚硝酸根为本实验室采用Uppu[6]等提出的方法合成;色谱级甲醇;试验用水为去离子水;其余试剂均为国产分析纯。
1.2 色谱条件
流动相A为甲醇,流动相B为去离子水。梯度洗脱:0~35min,流动相A由50%曲线梯度(Convex=5)增至90%;35min后流动相A保持90%;流速为1.5ml/min;检测波长为280nm。
1.3 实验过程
生理pH条件下,在一定体积磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4,0.1 mol?L-1)中,加入50 μl苯并[a]芘乙醇溶液(2 mmol?L-1)和100 μl p-ClFeTPPCl的乙醇溶液(5 mmol?L-1),搅拌中再加入1 mmol过亚硝酸根,总体积为10 ml。体系中B[a]P的终浓度为10 μmol?L-1、卟啉的终浓度为50 μmol?L-1、过亚硝酸根的终浓度为100 mmol?L-1,室温下搅拌反应1 h。然后加入2 ml乙酸乙酯,离心取上清液,真空干燥。不加过亚硝酸根的样品为对照实验。
干燥后的残留物用200 μl甲醇溶解,经孔径0.45 μm的滤膜过滤,取滤液进行色谱分析。
按照上述方法,比较了两种卟啉(p-ClFeTPPCl,Fe(F5P)Cl)组成的模拟体系对B[a]P代谢的作用。通过标准加入法,对B[a]P在p-ClFeTPPCl/过亚硝酸根作用下的反应产物进行了鉴定。
2 结果与讨论
结合对照实验,在过亚硝酸根分别与两种不同卟啉组成的模拟系统中,母体B[a]P在量上有不同程度的减少,根据公式

计算减少率。以Fe(PF5)Cl为P450模拟酶时,减少率为19.25%,而在p-ClFeTPPCl作用时,减少率则高达31.95%。说明卟啉与过亚硝酸根组成的模拟系统能诱导B[a]P代谢,p-ClFeTPPCl相对于Fe(F5P)Cl具有更好的作用效果。Fe(F5P)Cl在Keilko等的实验中作为细胞色素P450仿生酶,研究了多种氧化剂诱导B[a]P等对细菌的致突变作用[5]。本实验采用p-ClFeTPPCl为模拟酶,对B[a]P代谢的产物分布情况进行了研究。
利用HPLC手段,对B[a]P在p-ClFeTPPCl/ONOO-体系中代谢的产物进行了分析,结果见图1。通过标准加入法,确定了组分1为苯并[a]芘-9,10-二氢-9,10-二醇,组分5为苯并[a]芘-3,6-二醌,其余产物正在鉴定中。

Fig 1 HPLC of the metabolites of B[a]P induced by peroxynitrite
图1可以看出,在p-ClFeTPPCl模拟酶的作用下,过亚硝酸根已经诱导了B[a]P的代谢,导致一系列产物的生成。已鉴定的两种产物(苯并[a]芘-9,10-二氢-9,10-二醇、苯并[a]芘-3,6-二醌)在细胞色素P450作用下的B[a]P代谢也能产生。这些结果表明在仿生酶催化下过亚硝酸根能氧化B[a]P,从而诱导B[a]P的代谢。此外还证明了卟啉/ONOO-体系可以作为细胞色素P450的模拟系统,可用于研究B[a]P的代谢活化及其代谢产物的分析。
已报道的卟啉/氧化剂模拟系统都是以叔丁基过氧化氢、间位氯过氧苯甲酸及单过氧邻苯二甲酸镁等为氧化剂。但是,这些氧化剂在生物系统中是不存在的,以过亚硝酸根为氧化剂组成的模拟系统更加接近体内环境,并用这个模拟系统来研究B[a]P的代谢具有实际意义,也能更好地了解过亚硝酸根与多环芳烃代谢的关系。本文建立的p-ClFeTPPCl和过亚硝酸根组成的模拟系统为其他多环芳烃的代谢活化及其产物分析提供了新的途径。

参考文献
[1] Virág L., Szabó é., Gergely P., etal. Toxicol.Lett. 2003, 140-141:113
[2] Bai Y., Suzuki A.K., Sagai M., Free.Radic.Biol.Med. 2001, 30(5):555
[3] Tuo J., Wolff S.P., Loft S. Free. Radic.Res., 1998, 28:369
[4] Wood M.L., Smith J.R., Garner R.C.. Mutat. Res., 1988, 176(1):11-20.
[5] Keilko I.,Masataka M.Mutat.Res.,2002,519:133
[6] Uppu R.M., Pryor W. A. Anal. Biochem.. 1996, 236.242~249

Identification of Metabolic Products of Benzo[a]pyrene Induced by Peroxynitrite
Lin Taifeng1, Luo Yunjing1, Zhen Yan2, Sun Zhicheng1, Zhong Rugang1
(1. Beijing Polytechnic University, College of Life Science and Bioengineering, Beijing 100022, China;
2. Beijing Polytechnic University, College of Environmental and Energy Engineering, Beijing, 100022, China)

Abstract: A metabolic model system was established to study on the metabolism of benzo[a]pryene, taking porhporin as biomimetic enzyme for cytochrome P450 and peroxynitrite as oxidant in the system. Two model systems (FeT(PF5)Cl/peroxynitrite, p-ClFTPPCl/peroxynitrite) were compared that p-ClFTPPCl /peroxynitrite system is more efficient in metabolism of benzo[a] pyrene. We analyzed B[a]P metabolites induced by p-ClFTPPCl/ peroxynitrite system with HPLC. Two B[a]P metabolites were identified to be 9,10-dihydroxy-9,10- dihydrobenzo[a]pyrene and benzo[a]pyrene-3,6-quinone.The results provide evidence that peroxynitrite can induce the metabolism of benzo[a]pryene and p-ClFTPPCl/ peroxynitrite system can be used in studying on the metabolism of other PAHs.
Kewords:Chromatography; Peroxynitrite; Benzo[a]pyrene; Metabolism

 




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