固相萃取HPLC/MS法分析血中氯硝安定
 

固相萃取HPLC/MS法分析血中氯硝安定
吴忠贞 北京市公安局房山分局 (100085)
乔静 刘宪平 北京市公安局刑侦总队法医处 (100085)

摘要:目的 建立测定人血中氯硝安定的定性、定量方法。方法 在血液中添加氯硝安定,采用固相萃取、HPLC法分离、LC/MS法定性、定量。结果 标准氯硝安定LC/MS法的工作曲线在0.5~500ng时为Y=0.655×103X+2.15×103,相关系数r=0.9981,最小检出限为0.5ng/mL。 结论 采用pH8.0的磷酸盐缓冲液进行稀释、C18柱固相萃取氯硝安定回收率较高,优化后固定的LC/MS检测方法简便、快速、准确,适合办案需要。
关键词:血样品 氯硝安定 固相萃取 HPLC/MS

       氯硝安定(Clonazepam)易溶于丙酮、氯仿中,服药后1~2小时血中浓度达到峰值,半衰期24~48小时,蛋白结合率约50%,它的7—硝基被还原成氨基物,为主要代谢物,随尿液排出。
       氯硝安定的分子式为C15H10ClN3O3,为弱碱性药物。
1.材料与方法
1.1 仪器和试剂
1.1.1 HP1100高压液相色谱仪,API2000液相/质谱联用仪,配有API2000色谱工作站。
液相条件:
色谱柱:MsC18(2.1×150mm)3.5um,柱温35℃,进样量5uL,流速0.3mL/min。
流动相: B已腈 C 10mM甲酸铵 D甲醇(液相用溶剂为色谱纯)
梯度(%):0min 20 80 0
                       12min 100 0 0
                       15min 10 80 10
                       17min 20 80 0

离子源为ESI源,气帘气CUR:10.0,碰撞气CAD:5,离子化电压IS:5500V,温度TEM:488℃,雾化气Gas1:53.0,辅助加热气Gas2:43.0,去簇电压DP:80,聚焦电压FP:400,碰撞能量CE:40,EP:12,CXP:15.0,DF:-200,CEM:2500.0;质谱扫描方式为MRM,正离子检测。氯硝安定的三对特征离子分别为:316.1/270.0、316.1/214.0、316.1/241.2,以离子对316.1/270.0为定量离子。
1.1.2 MT800型离心机(4000r/m);
1.1.3 C18固相萃取柱(500mg,安捷仑产);
1.1.4 0.2u和0.45u有机过滤膜(安捷仑产);
1.1.6 10mmol/L甲酸铵(pH3~4):准确称取0.63g甲酸铵,溶于约含950mL去离子水的1000mL容量瓶中,用甲酸调节pH为3~4后加水至刻度,混匀,过0.45u滤膜。
1.1.7 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0或pH8.0):6.0g磷酸二氢钠溶于450mL去离子水中,用1.0mol/L氢氧化钠调节pH为6.0或pH8.0后定容至500mL。
1.2 实验方法
1.2.1标准工作曲线的绘制:将标准氯硝安定配制成浓度分别为(ng/mL):0.5、2.5、5、25、50、150、250、500,绘制标准工作曲线。
1.2.2样品制备:空白新鲜血液1.0mL,添加10ug/mL的氯硝安定20uL,摇匀后室温放置1h,备用。
1.2.3 C18柱固相萃取法:
制备样品:取1.2.2中的样品3份,用pH8.0的磷酸盐缓冲液7.0mL稀释,离心,上清液备用。
柱活化:使用前依次过甲醇5mL、去离子水5mL、pH8.0的磷酸盐缓冲液5mL,流速3mL/min,保持液面,备用。
加样:将离心出的上清液加到活化好的C18柱中,流速1mL/min。
洗涤:依次用3mL pH8.0的磷酸盐缓冲液、3mL去离子水洗去杂质,流速3mL/min,并用吸耳球挤干柱内水分。
洗脱:用3mL 2%充氨氯仿/异丙醇(4∶1)洗脱,收集洗脱液,水浴挥干,乙腈定容后,过0.2u过滤膜,供检。
2结果
2.1标准氯硝安定LC/MS法的工作曲线在0.5~500ng时为Y=0.655×103X+2.15×103,相关系数r=0.9981,最小检出限为0.5ng/mL。
2.2 该提取方法回收率见为73.5%,RSD为1.8。
3讨论
3.1由于氯硝安定属于弱碱性药物,我们采用pH8.0的磷酸盐缓冲液进行稀释,既有水解又有调节pH的作用,C18柱的回收率在73.5%,适合办案需要。
3.2气相色谱/质谱法对氯硝安定的检测灵敏度偏低,所以我们采用HPLC/MS法(MS/MS图见图2),LC/MS的灵敏度很高,定量稳定(HPLC/MS图见图1)。


图1 氯硝安定的HPLC/MS图


图1 氯硝安定的MS/MS图

参考文献
1.乔静,等,《HPLC及LC-MS法测定全血中青霉素》,分析测试学报,2004年增刊,P30-31。
2.杨士云,等,《生物检材中氯敌鼠的LC-MS分析》,分析测试学报,2004年增刊,P32-34。

 




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