高效液相色谱法测定新型生物农药楝树油素的有效成分
 

高效液相色谱法测定新型生物农药楝树油素的有效成分
刘绍从,吕刚,孙书军 ,郑群, 马军
(天津出入境检验检疫局,天津 300042)
摘要:用高效液相色谱法测定新型生物农药楝树油素原药及制剂的有效成分含量。色谱柱Zoba×Extend C18,25.0cm×4.0cm,5μm;流动相:乙腈+水,440+560( v/v);流速:1.2mL/min;柱温:30ºC;进样量:20μL;检测波长:214nm。回收率:原药,98%~102%;1%EC,97%~103%。精密度:原药,0.12%;1%EC,0.18%。
关键词:楝树油素,测定波长,高效液相色谱法
Determination of Active Ingredient in New Type biology pesticide Azadirachtin by HPLC
LIU Shao-Cong, LU Gang, SUN Shu-Gong, ZHENG Qun,MA-Jun
(Tianjin entry exit inspection and quarantine bureau, Tianjin 300042 China)
Abstract: Determination of active ingredient in new type biology pesticide Azadirachtin was established using high performance liquid chromatograph (HPLC). The HPLC conditions are as follows, column: Zoba×Extend C18,25.0cm×4.0cm,5μm; mobile phase: acetonitrile+water, 440+560( v/v);flow r ate: 1.2mL/min; column temperature: 30℃; inject volume: 20μL ; detection wavelength: 214 nm. The recovery was 98%~102% for technical and 97%~103% for 1% EC. The precision was 0.12% for technical and 0.18% for 1%EC.
Key words: Azadirachtin,Determination wavelength,HPLC
楝树油素(Azadirachtin) 是由(印)楝树果实中提取一种广谱性生物农药,具有高活性的昆虫拒食作用和昆虫生长调节作用[1-3],可防治200多种农、林、仓储和卫生害虫,对鳞翅目、鞘翅目和双翅目等害虫有特效,是替代化学农药的首选产品。德国Trifolio-M GmbH公司研发的新型生物农药Azadirachtin,其原药有效成分含量约为34%,制剂主要是1%乳油(EC)。
楝树油素有效成分的化学名称为:二甲基[2aR[2aα,3β,4β(1aR*,2S*,3aS*,6aS*,7S*,7a S*), 4aβ,5α,7aS*,8β(E),10β,10aα,10bβ]]-10-(氧化乙酰)-八氢-3,5,-双羟基-4-甲基-8[(2-甲基-1-氧-2-丁烯基)-氧]-4-(3a,6a,7,7a-四氢-6a-羟基-7a-甲基-2,7-亚甲基-糠酸[2,3-b]环氧乙烯[e]氧化频-1a(2H)-基)1H,7H-萘酚-[1,8-bc: 4,4a-c’]: 呋喃-5,10a(8H)-二羧酸酯(CA)。
作者简介:刘绍从(1965-),男,河北栾南人,高级工程师,博士在读,主要从事化学品的检测研究。电话:022-83326956,E-mail:Liusc@tjciq.gov.cn;通讯地址:天津市河西区浦口道6号,邮编:300042;单位:天津出入境检验检疫局化工危险品实验室。
结构式为:

楝树油素原药和制剂中有效成分含量的分析方法国内目前未见报道。本文在实验研究的基础上,建立了高效液相色谱法测定新型生物农药楝树油素原药及制剂的定量分析方法。
1、 实验部分
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器
高效液相色谱仪:Waters996二极管阵列检测器,515恒流泵,20μL定量环;Millennium32色谱工作站;超声水浴:昆山市淀湖检测器厂KQ50型。
1.1.2 试剂
乙腈,水,甲醇均为液相色谱纯;楝树油素分析标准品,97.0%(由Trifolio-M公司提供)。
1.2 色谱条件
色谱柱:Zobax Extend C18,25.0cm×4.0cm,5μm;流动相:乙腈+水,440+560( v/v);流速:1.2ml/min;柱温:30℃;进样量:20μl;检测波长:214nm。
1.3 溶液的配置
1.3.1 标准溶液
配制两份标准溶液,称取约10mg(精确至0.01mg)楝树油素标准品于50ml容量瓶内,用甲醇溶解并定容。准确移取5ml溶液于50ml容量瓶中,用流动相定容(C1 和C2)。
1.3.2 样品溶液的配置
原药样品溶液:配置2份。称取约含10 mg有效成分的样品(精确至0.01mg)于50ml容量瓶中,用甲醇溶解并定容。准确移取溶液5ml于50ml容量瓶内,用流动相定容(S1 和S2)。
1%EC样品溶液::配置2份。称取约含1 mg有效成分的样品(精确至0. 1mg)于50ml容量瓶中,加2ml甲醇溶解,用流动相定容,放入超声水浴超声30s (S1 和S2)。
1.4 测定
1.4.1 色谱系统平衡
向色谱系统连续注入标准溶液(20μl),直到连续3次的保留时间相对偏差在±1.0%之内,峰面积的相对偏差在±2%之内,此时可视色谱系统已平衡,可以进行测定。
1.4.2 线性检查
待色谱系统平衡后,向系统注入浓度分别为分析标准溶液浓度0.5,1和2倍的检查标准溶液,检查色谱响应是否成线性关系。若线性良好,则进行样品测定,否则,重新平衡色谱系统。
1.4.3 样品溶液测定
待仪器正常后,按下列次序进样(20μl): C1,S1,S1,C2,S2,S2,C1 ,用外标法得到样品中有效成分的质量百分含量。曲型色谱图见图1。

1- Azadirachtin
图1 Azadirachtin 的典型色谱图
2、 结果与讨论
2.1 紫外波长的选择
在选择方法时,我们首先在上述色谱条件下对标准溶液进行了紫外全扫描,见图2。从扫描结果得:目标物在200nm~240nm范围内有紫外吸收,在214nm处吸收值最大,且无干扰,能够保证测定的精确度和准确度。
2.2 溶剂和流动相的选择
根据样品的性质,宜采用反相液相色谱法分离。反相液相色谱的流动相溶剂主要有:乙腈、甲醇和水。通过实验,样品在甲醇中的溶解度较大,用甲醇和水做流动相,可避免溶剂效应,但有效
成份的峰形较差。而乙腈和水做流动相峰形对称,定量精度更高。通过实验优化,确定:乙腈+水440+560(v/v)做流动相;样品用甲醇溶解后,用流动相定容。这样即保证了有效成分的形峰对称,也避免了溶剂效应。


图2 Azadirachtin的紫外光谱图
2.3 方法的准确度
分别在原药和1%EC的样品中加入适量标准样,在上述色谱条件下进样,每次20μl,平行测定3次,计算回效率。测得的结果经F. t检验无异常值,均进入统计计算。结果表明:方法的回收率:原药,98%~102%之间;1%EC,97%~103%之间。符合定量分析要求。
2.4 方法的精密度
在上述色谱条件下,分别取原药和1%EC的样品各一份,每一份样品平行测定6次,分别测定各次的保留时间和有效成分的质量百分含量,结果经F, t检验无异常值,均进入统计计算,求取平均值和RSD。结果表明RSD值分别为:原药,0.12%;1%EC,0.18%。符合定量分析要求。
3、 结论
作者在实验研究的基础上,建立了高效液相色谱法分离测定新型生物农药楝树油素的方法。采用反相液相色谱分离,外标法定量。该方法操作简单,快速准确,适用于楝树油素原药及制剂有效成分的定量分析。

参考文献
1. 严福顺。印楝树成分Azadirachtin和Salannin对菜粉蝶幼虫的拒食作用,动物学集刊; Vol.12,1995。
2. 嵇保中,赵博光。吴如其印楝提取物及双稠哌啶类生物碱对桑天牛存活及生殖的影响,南京林业大学学报;1000-2006; Vol.22,
No.1,1998。
3. 罗晓乐,吴少华。印楝提取物的杀虫活性及其中四降三萜研究,天然产物研究与开发;1001-6880; 2001,013(001)。




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