DA、5-HT及其代谢产物HPLC-ECD
检测方法的研究
徐 敏
（1. 北京理工大学生命科学与技术学院 北京 100081）
摘要： 本研究采用高效液相色谱结合库仑阵列多电极检测器体系（HPLC－ECD）建立了一套操作简便、高效、快速测定多巴胺(DA)、3，4-二羟基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)、5-羟色胺(5-HT)以及5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)的方法，并探究了检测的灵敏性，浓度和响应因子之间的线性关系，系统的稳定性等。DA、DOPAC、HVA、5-HT及5-HIAA的相关系数分别为0.9964、0.9999、1、0.9989、0.9999；HVA和5-HIAA的检测限都低于0.5ng/mL， DA、DOPAC及5-HT的检测限均低于0.1ng/mL，各种物质的方法回收率为85.6%－107.4%。

关键词： HPLC－ECD；神经递质，检测方法
A HPLC-ECD method to study DA, 5-HT and their metabolite of the neural stem cell
Deng Yulin1, XU Min1,Yang Wei1
(1. Life Science Department, Beijing Institute of Technology, Beijing, 100081)
Abstract: High performance liquid chromatography (HPLC-ECD) was used for measurement of the neurotrasmitters. In our study ,the method of measuring DA, DOPAC, HVA, 5-HT and 5-HIAA was established, and we described systematic investigations of various factors involved in contributing to the reliability and reproducibility of the neurotrasmitters measurement. These factors include sensitivity of detection, limits of linear relationship between concentration and the response factor, stability of the system. The response factor of DA、DOPAC、HVA、5-HT and 5-HIAA are respective 0.9964、0.9999、1、0.9989 and 0.9999. The limit of detection of HVA and 5-HIAA are below 0.5ng/mL ,and DA、DOPAC、5-HT are below 0.1ng/mL .
Key words： HPLC－ECD，neurotrasmitter，test methods

单胺类神经递质包括多巴胺、5-羟色胺及其相关化合物【1】，是人脑内神经元中普遍存在的、十分重要的神经递质。多巴胺、5-羟色胺及其代谢物的测定对研究很多神经系统疾病有着非常重要的意义【2，3】。但由于其在脑内、细胞内含量极低【4，5】，这给生物样品的检测带来了很大的困难。本研究建立了一种简便的、灵敏的高效液相色谱电化学检测器的方法，同时对多巴胺、5-羟色胺、高香草酸、5-羟吲哚乙酸及3，4-二羟基苯乙酸进行分离和检测。为今后生物样品中这些物质的检测提供了很有价值的信息。
1．实验部分
1．材料与方法
2.1 实验仪器
美国ESA公司高效液相色谱仪：包括两台582型恒压微流活塞泵、542型86孔自动进样器、5600A型八通道库仑阵列检测器及配套色谱工作站。
2.2 药品及试剂
DA、DOPAC、HVA、5-HT及5-HIAA的标准品均购自Sigma公司；甲醇、乙腈均为色谱纯，购自Fisher公司；其他试剂均为分析纯，购自北京化学试剂公司；实验用水为18.2MΩ三蒸水。
2.3 色谱条件
色谱柱：Alltima C18（5μm 150mm×4.6mm）；
流动相：甲醇：乙腈：三蒸水=2.5：5：92.5；缓冲液中含有：36mM的柠檬酸、47mM的磷酸二氢钠、0.3mM的乙二胺四乙酸二钠以及0.35mM的庚烷基磺酸钠，pH调至为4.1，将配置好的流动相经过0.22μm有机膜过滤，真空脱气30分钟待用。
检测条件：流速：1mL/min；柱温：30℃；检测电势：0－245mV(+35mV)；进样量：40μL；
2.4 标准样品的制备
精确称量DA、DOPAC、HVA、5-HT以及5-HIAA各a mg，溶解于a mL的三蒸水中制成1mg/mL的月母液；将月母液稀释200倍成周母液（5000ng/mL），将月母液、周母液保存于-4℃冰箱中（月母液的保存期一般不超过一个月；周母液的保存期一般不超过一周）。在测定时将周母液当日稀释成所需浓度即为日标准溶液，本实验中标准单样的浓度为50ng/mL，标准混合样的浓度梯度为：100、50、20、10、5、2、1、0.5ng/mL。最后根据峰面积与浓度作直线回归，并求出相关系数。
2．结果与讨论
2.1 色谱条件的选择
流动相为含有甲醇、乙腈的柠檬酸－磷酸盐缓冲溶液（pH4.1），改变甲醇和乙腈的量可以影响分离、分析效果。经过多次实验的摸索，确定甲醇和乙腈的体积百分比分别为2.5%和5%时样品有较好的保留时间以及分离效果。在确定有机相配比后，利用NaOH调节流动相的pH值，以求得到较好的分离效果。本实验中尝试了一系列的pH梯度，最后确定pH为4.1。根据各种标准样品的伏安曲线确定其最佳电势（图1）。各种标准样品的最佳电势分别为：DA：100mV；DOPAC：175mV；HVA：250mV；5-HT：140mV；5-HIAA：175mV。

图1 各种标准样品的伏安曲线
2.2 标准混合样的分离效果
采用前面所述的流动相及检测方法，所得到的HPLC色谱图清晰，由图2可以看出DA、

 图2 五种标准样品的分离色谱图
DOPAC、HVA、5-HT以及5-HIAA达到基限分离。
2.3 线性范围和检测限
本系统对于DA、5-HT及其代谢产物在0.5－100ng/mL有着良好的线性关系。在系统稳定的情况下，各种物质的检测限均在0.5ng/mL以下，结果如表1所示。
2.3 样品的标准曲线及相关系数
将标准混合样配成浓度梯度，具体浓度为：100、50、20、10、5、2、1、0.5ng/mL。各种物质的标准曲线如图3所示。

图3 各种标准样品的标准曲线

各种标准样品的峰面积与浓度进行线性回归，得到回归方程及相关系数如表1所示。
表1 各种标准样品的回归方程、线性范围、相关系数及其最低检出限

2.4 精密度与回收率
从标准曲线上取三个浓度点分别做日内和日间精密度，日内进行5组平行实验、日间进行6组平行实验，取最好的一个浓度点得到各种组分的日内及日间精密度，结果如表2、3所示；再对这三个浓度点进行5组平行实验，同样选取一个最好的浓度点，根据各组分的标准曲线计算出各个组分的方法回收率，结果如表4所示。

表2 各种标准样品的日内精密度

表3 各种标准样品的日间精密度

表4 各种标准样品的方法回收率

3. 小结
综上所述，该色谱方法灵敏、快速、且分离效果好，全部5种物质同时分离，其测定时间不到20分钟，方法有着很好的重现性和较高的回收率，且最低检测限低于0.1ng/mL，对生物样品痕量检测提供了一种很好的方法。根据实验的需要，单测一种或某几种物质，这就使其应用范围更广、更灵活。
参 考 文 献
[1] 薛启冥.神经系统的生理和病理化学[M].第二版.北京：科学出版社，1992.180-218.
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