尿样中4种β-激动剂残留GC-MS确证检测技术研究

凌建刚1,2 ，赵健2 ，陈国2 ，朱勇2，任燕萍2 ，吴平谷3

（浙江大学环境工程系1，杭州310029；农业部农产品质量安全监督检验测试中心（宁波）2，宁波315040；浙江省疾病预防控制中心3，杭州 310009）

［摘要］应用SLH固相萃取净化、BSTFA+TMCS衍生、气相色谱－质谱联用仪（GC-MS）同时检测确证尿样中4种典型β－激动剂（克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林）的残留量。采用简化的前处理净化和衍生技术，结合扫描和选择离子监测技术，通过标准添加和对特异性酶联免疫法初筛呈阳性样品再确证，建立了一套应用GC-MS技术检测确证β－激动剂多残留的方法。方法具有准确率高、速度快、成本低等优点，方法最小检出限为0.5 ug/kg。

［关键词］气相色谱－质谱；激素；确证检测

A Multiresidue Method for the Determination and Definite evidence of 4 β-Agonists Residues in Urine kind by GC-MS

Ling Jian-Gang1，2,Zhao Jian2，Chen Guo2，Zhu Yong2，Wu Ping－Gu3

（Environment Engineering Department of Zhejiang University, Hangzhou, 310029;The Supervision, Inspection & Testing Center (Ningbo) Of Agricultural Products Quality ＆ Security，Ministry Of Agriculture，Ningbo, 315040; The Center of Prevention and Control of Disease of Zhejiang3,Hangzhou,310009）

［Abstract］  A multiresidue analytical method for determination and definite of Clenbuterol, Ractopamine, Salbutamol, Terbutaline residues in Urine using Gas Chromatography-Mass Spectrometry(GC-MS) has been Established. After the Urine samples`s pH were adjusted, further cleanup was performed on a LSH carridge and the purified drugs were derivatized with ［N,O-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA) –trimethylchlorosilane (TMCS),99:1］, scan and selected ion monitoring(SIM)methods were applied for detection and definite. The method has the accurate rate high, the speed is quick, low etc. in cost advantage, with the detection limit of 0.5ug/kg respectively.

［Key words］  GC-MS; β-Agonists Residues; Determination; Definite

1、   前言

违禁药物“瘦肉精”—盐酸克仑特罗已

受到了社会各个层面的广泛关注,实际上这并

收稿日期：

基金资助：宁波市农科院院长基金项目2003

作者简介：凌建刚（1973－），男，农艺师，主要从事兽药残留、环境污染控制研究。

不是中国所特有的问题,早在上个世纪80年代末，欧洲和美国就陆续宣布禁用，但在90年代初却在欧洲许多国家都出现了多次严重的中毒事件，事后虽然它一直是欧盟和美国的监控重点，但至今使用仍未绝迹，还演绎出10多种类似作用的β－激动剂类药物。近年来，“瘦肉精”受到严查，一些不法商贩就想方设法使用替代品。目前，市场上已先后出现两种“瘦肉精”的替代品－莱克多巴胺、沙丁胺醇。作为盐酸克仑特罗（瘦肉精）的替代品，莱克多巴胺、沙丁胺醇等新一代β2-激动剂已对我国畜产品和饲料安全构成新的威胁。鉴于国家和行业检测标准的相对滞后，上海、浙江等地先行制订了饲料、尿样等基质中盐酸克仑特罗和沙丁胺醇两个激素的单项检测方法，目前国内尚无上述激素多残留检测方法。克仑特罗、莱克多巴胺特异性酶联免疫试剂盒初筛阳性者必须由GC-MS确证，并进一步查沙丁醇胺和特布他林残留。

2、   实验部分

2.1 主要仪器、材料和试剂

仪器：美国安捷仑Agilent 6890N-5973MSD气相色谱－质谱联用仪（四极杆，EI离子源， MSD chem. NT4.0英文工作站，HP-5MS弹性石英毛细管柱，柱长30 m、内径0.25 mm、膜厚0.25 mm）；高速离心机，涡流混合器（或超声波混合器），固相萃取（SPE）装置；旋转蒸发仪，氮吹仪，烘箱。

材料：生猪尿样、SLS净化柱（500mg/5mL）、SLH净化柱（500mg/5mL）。

试剂：正己烷，甲醇，甲苯，蒸馏水，氨化甲醇（2％，5％），无水硫酸钠，盐酸（1：1，30mmol/L），衍生试剂：99%BSTFA（双三甲基硅基三氟乙酰胺）+1%TMCS（三甲基氯硅烷）。

标准溶液：克仑特罗、莱克多巴胺、特布他林、沙丁胺醇标准甲醇储备液100ug/mL，用甲醇（色谱纯）稀释至1ug/mL标准工作液。

2.2 仪器工作条件

2.2.1 气相色谱条件

载气为99.999％高纯氦气，柱前压80Kpa，柱流速1.0 ml/min；不分流进样方式； 进样口温度：230 ℃；传输线温度：250 ℃；进样量2mL；升温程序：初始温度120 ℃，保持3 min，以10 ℃/min速率升温至280 ℃，保持7 min；

2.2.2 质谱条件

EI离子源，电子能量70 eV，温度230 ℃；检测器电压为1.42 kV；全扫描（Scan）质量范围：50-500 amu；选择离子扫描（SIM）特布他林（86，356）、克仑特罗（86、262、243）、沙丁醇胺（86、369、440）、莱克多巴胺（250、267、502）组成离子组；质谱仪经全氟三丁胺（PFTBA）自动调谐，灵敏度和分辨率达到最佳匹配；溶解延迟6min。

2.3 分析步骤

2.3.1 样品提取

方法一：取尿样10mL于25mL离心管，用1mol/L NaOH调pH10，加1g NaCL,振摇溶解，加10mL叔丁基甲醚，涡旋1min，中速振荡10min，5000rpm离心5min, 上清液经无水硫酸钠过滤，收集于50mL旋转蒸发瓶；另取10mL叔丁基甲醚重复提取一次。用2mL甲醚淋洗无水硫酸钠，合并滤液，旋转蒸干，用2mL乙酸乙酯溶解，待过SLS柱。

方法二：取尿样5mL（批量检验时每10份加1ug/mL 混标工作液200ul作加标回收控制）,用1:1HCL调pH2,离心，待过SLH柱

2.3.2 样品净化

方法一：SLS柱活化（依次用5mL甲醇，5mL水，5mL 3mmol/l HCL），上样，然后用5ml水，5ml甲醇淋洗，最后用10％氨化乙酸乙酯洗脱，收集于10ml试管，加入无水硫酸钠，涡旋，离心，取5ml清液，吹干，加2.5ml乙酸乙酯，2.5ml乙醚，超声10min，离心5min，氮气吹干，待衍生。

方法二： SLH柱活化（依次用5ml甲醇，5ml乙酸乙酯），上样，用5mL50％甲醇/乙酸乙酯洗脱，另取3ml3％甲醇/乙酸乙酯洗涤旋转瓶，过柱，收集洗脱液，氮气吹干，待衍生。

2.3.3 衍生

加100ul衍生试剂，混匀密封后置80℃烘箱衍生30min，氮气吹干，加200ul甲苯溶解， 2uL GC－MS手动进样或用带衬管的进样瓶自动进样。

3、结果与讨论

3.1 提取方法的选择

方法一是DB33/T536-2004 第三法GC-MS法采用的方法，步骤较繁琐；比较而言，方法二具有快速、简便等优点，更适用于批量样品的提取。提取的回收率可达到86.8%，与方法一接近。

3.2 净化方法的选择

常用的净化方法有液-液分配法、SPE法等。液-液分配法简单，但净化效果较差；SPE净化法操作过程较繁琐，但净化效果较理想。因尿样提取液成分较复杂，会干扰检测，故选用SPE净化法。但不同组分的SPE柱其过柱程序不同，采用SLH柱程序较简便。

3.3 色谱条件的优化

尿样经过净化处理，但部分杂质依然存在，为达到分离完全，避免杂质干扰测定，本文选择程序升温，并采用低流失毛细管MS专用柱。为了对组分进行准确的定量分析，本文选择不分流进样方式，避免分流进样时分流比的轻微改变对定量结果重现性的影响。

3.4 质谱条件的优化

采用自动调谐，以提高灵敏度。为了确证组分，先采用SCAN全扫描对衍生后的标样进行定性分析，获得目标组分的全质谱图及其保留时间等信息，见图1、图2。由于NIST98库中只有盐酸克仑特罗标准质谱图，莱克多巴胺、特布他林、沙丁胺醇三个组分，本文通过较高浓度标样SCAN方式建立保留时间和典型质谱图，见图3、图4；再采取选择离子扫描（SIM）对该样品进行定量分析。

3.5 方法的回收率和检出限

向5mL 尿样中加入1.0 mg/L 4种混标溶液20OuL，按照上述方法进行回收试验，方法一回收率为89.2 %，方法二回收率为86.8％。本方法最小检出限为0.5 ug/kg。

4、   结论

本研究建立了应用GC-MS一次性检测确证尿样中克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等4种β2－激动剂的技术。对4种激动剂应用同一提取、净化（方法二）及GC-MS优化测定程序，提高了检测效率。该方法具有快捷的前处理和准确确证能力。气相色谱－质谱联用技术在激素、抗生素、农残等的定性定量分析方面具有较强的优越性，尤其是在样品中干扰杂质较多的情况下，通过质谱快速准确的定性检测具有十分重要的意义。

参考文献：

［1］ 常碧影，宋 荣，生物材料中β－激动剂的测定方法综述，饲料广角，2002 ，No.20，P.19-21.

［2］ N/T 0005－1996，出口商品中农药、兽药残留及生物毒素检测方法标准编写的基本规定［S］.

气质联用（GC-MS）,液质联用（LC-MS）及电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）在饮用水中农残、兽残及有机物检测中的应用，Agilent Technologies,2001.05.

［3］吴平谷，吴惠玲，气质色谱法研究克仑特罗的衍生化测定方法，理化检验，2001,Vol37增刊，化学分册，15～16.

［4］JIJAK P Confirmation of Chloramphenicol Residues in Bovine Milk by GC/MS［J］,J AOAC Int,1994,77(1):34～40.