ASE200-HPLC检测黄姜中薯蓣皂甙元含量
方法的研究
贾林1，刘红妮1，张翠娥2，刘敏2
（1.西安近代化学研究所四部；2.西安近代化学研究所十部，陕西西安710065）

摘要 目的：建立测定黄姜中薯蓣皂甙元含量的方法。方法：用ASE200提取皂甙元，用HPLC检测，以甲醇作为流动相，流速1ml/min，UV检测器，测定波长210nm， Hanbon Science & Technology Co., Ltd YWG C-18柱（150×4.6mm，10μm）。结果：无明显干扰峰，线性范围为0.25～2.82 mg•mL-1（n=7，r=0.9996），最小检出限0.001 mg•mL-1，平均回收率为98.5％ ，RSD＝1.1％ 。结论：该法准确、分离效果好、直观、干扰少，适合于薯蓣皂甙元生产工艺全过程含量测定。
关键词 黄姜；薯蓣皂甙元；ASE200
Research on Determination of Diosgenin in Dioscorea zingiberensis by ASE200-HPLC
Jia Lin1, Liu Hong-ni1, Zhang Cui-e2, Liu Min2
(1. 4th Dep. Xi’an modern chemistry research institute; 2. 10th Dep. Xi’an modern chemistry research institute ，Shanxi Xi’an 710065)
Abstract Objective: To establish determination of the content of Diosgenin in Dioscorea zingiberensis. Methods: The Dioscorea samples were extracted by ASE200 and determinated by HPLC. The analytical column was Hanbon Science & Technology Co., Ltd YWG C18（150×4.6mm，10μm）. The mobile phase was methanol, the flow rate was 1.0 mL•min-1, the UV detector wavelength was 210nm. Results: The average recovery was 98.5% and RSD was 1.1%(n=7). There was a good linear relationship within the range of 2.82~0.25 mg•mL-1(r=0.9996). The detection limit was 0.001 mg•mL-1 . Conclusion: The method is accurate, sensitive and suitable for the quality control in Dioscorea production.
Key words Dioscorea zingiberensis; Diosgenin; ASE200

从黄姜根状茎中提取的薯蓣皂甙元（俗称皂素）是合成甾体激素药物的基础原料和起始中间体。据介绍，世界上近９０％薯蓣皂甙元靠中国供应，每吨出厂价格最高时达到近６０万元。黄姜提取皂甙元工艺近50年来一直采用的是发酵法生产，生产工艺落后，技术含量低，其工艺只获取了占黄姜1%的皂素，而占黄姜50%的纤维、40%的淀粉在发酵进行酸水解时，变成了大量的废渣和废水，排泄出来。按照现有的方法来治理黄姜加工过程中出现的这种污染，极难达标，加之治污运行费用过高，皂素生产厂家难以接受，黄姜酸解液污染治理成了世界性的难题。黄姜污染综合治理是保护百万姜农利益和巩固农业结构调整成果的现实要求。
我们认为只有革新生产工艺才能从根本上减少污染。鉴于《中国药典》并未提供含量测定方法，我们需要建立一个准确、直观、可以检测工艺中各环节皂素含量的方法。我们选择ASE200提取薯蓣皂甙元，用HPLC外标法进行测定。

作者简介：贾林（1970－），女，河北人，高级工程师，主要从事色谱方面和化学分析方法的研究
1 试验部分
1.1 主要仪器与试剂
美国VARIAN ProStar高效液相色谱仪；梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司AL204电子天平；美国戴安ASE200加速溶剂萃取机；上海实验仪器厂有限公司101A-1B型电热鼓风干燥箱；北京长风仪器仪表公司HH•SY21-Ni电热恒温水浴锅。
薯蓣皂甙元对照品：将提取的薯蓣皂甙元经过多次重结晶，用流动相溶解，在HPLC上检测，用面积归一化法计算含量为96.03％，熔点为204.2℃。
用作流动相的甲醇为色谱纯，用于提取的甲醇为经HPLC检测不含薯蓣皂甙元的回收甲醇，浓硫酸为分析纯，水为蒸馏水。
1.2 ASE200和HPLC试验条件
ASE200条件：用甲醇作为提取溶剂，选取11ml萃取池，萃取温度100℃，萃取压力1500psi，静态萃取时间为10min，冲洗溶剂体积比例：80％，氮气吹扫60sec，萃取1次。
HPLC条件：UV检测器：波长210nm；色谱柱：Hanbon Science & Technology Co., Ltd YWG C18柱（150×4.6mm，10μm）；流动相：甲醇，流速1ml•min-1；进样量：20μl（由定量阀控制）。
1.3 样品溶液和标准溶液的制备
样品溶液的制备：准确称取黄姜样品（约含0.03g薯蓣皂甙元）加2M的硫酸溶液80ml在沸水浴上酸解4hr，中和，抽滤，残渣100℃烘干。将残渣连同滤纸一起放入ASE200的萃取池中，按ASE200的条件进行萃取。萃取完后，将收集瓶中的液体转移至50ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。
薯蓣皂甙元标准溶液的制备：准确称取薯蓣皂甙元对照品加流动相配置成0.5 mg•mL-1的溶液，即得，贮存于低温处。
1.4 测定
待HPLC仪器稳定后，首先注入标准液，再注入样品溶液，观察出峰情况，色谱图见图1。记录色谱峰面积，单点校正法计算结果。甲醇回收。


图1 薯蓣皂甙元对照品（A）、除去纤维素和淀粉的黄姜样品（B）、酸解过黄姜样品（C）、提取残渣样品（D）色谱图
Fig 1 Chromatograms of reference substance (A), sample without fibrin & starch (B), sample after acidified (C), solid waste after processed (D)
2 方法与结果
2.1 线性试验

准确称量不同质量薯蓣皂甙元对照品分别置于7个50ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，振摇使溶解完全，用HPLC检测，TR＝（7.1±0.2）min，以峰面积(Y)，对标准溶液浓度（mg•mL-1）作线性回归，得到工作曲线Y=744068.03733+1.59283×107×X（n=7）， r=0.9996。可知薯蓣皂甙元在2.82~0.25 mg•mL-1浓度范围内线性关系良好。
2.2 最低检出限试验
在选定的色谱条件下，当信噪比为3时对最低检出限进行测定，结果表明薯蓣皂甙元的最低检出限为0.001 mg•mL-1。
2.3 精密度和准确度试验
精密度试验：吸取1.01 mg•mL-1对照品溶液，重复进样8次，测定峰面积，计算RSD＝0.6％。
准确度试验：取同一批生产中已经酸解过样品，称量不同重量的5份，平行进行ASE200提取和PHLC测定，测定峰面积，计算RSD＝1.2％。
2.4 稳定性试验
取2.23 mg•mL-1、1.96 mg•mL-1两个对照品溶液，一个月内不定期检测，测定峰面积，RSD分别为0.5％（n=6）和0.9％（n＝8）。
2.5 酸解时酸浓度的影响试验
一共试验了6批需要酸解的样品，按上述1条件（酸解时具体酸的浓度见表1）分别检测薯蓣皂甙元的含量，测定结果见表1，可以看出2M硫酸溶液酸解较完全。
表1 硫酸溶液的浓度对酸解效果的影响

Table1 Results of samples by different content of H2SO4 solution

2.6 ASE200条件的选择试验
将适量薯蓣皂甙元对照品放入一个萃取池中，用ASE200分别萃取至两个收集瓶中，用HPLC检测第二个收集瓶中的液体是否含有薯蓣皂甙元。逐步调解ASE200的操作参数，直至第二个收集瓶中无薯蓣皂甙元被检出。
2.7 回收率试验
表2回收率测定结果（n＝7）
Table 2 The recovery determination results

准确称量0.05g薯蓣皂甙元对照品加到经检测不含有薯蓣皂甙元的黄姜生产废渣中，按上述1操作（不用酸解），检测薯蓣皂甙元的含量，数据见表2，平均回收率为98.5％(n=7)，RSD＝1.1％。结果表明回收完全。
2.8 样品测定
检测4批样品：样品1为某批工艺中已经除去淀粉和纤维素的黄姜；样品2、3、4为3批工艺中已经酸解完的黄姜。依照上述1条件每批分别检测5个平行样，计算薯蓣皂甙元含量，可得薯蓣皂甙元含量和RSD（n=5），数据见表3。可见此分析方法能满足生产需要。
表3 样品检测结果
Table 3 Results of samples determination

3 结语与讨论
1. 薯蓣皂甙元的检测方法有重量法[1]、薄层扫描法[2]、旋光法[3]、分光光度法[1，4～6]、HPLC法[7]等。重量法误差较大，分光光度法要先对提取物脱色，会带来一定的误差，旋光法不适合粗提物检测[8]，HPLC能克服上述所有的缺点，而且能较直观地观察样品含量的变化，所以我们选择了HPLC。
2. 薯蓣皂甙元的提取有回流提取[1，2，7]、索式提取[6]、微量浸提法[1]等。回流提取和索式提取时间较长（一般7hr左右），微量浸提法要求浸取液中薯蓣皂甙元浓度要远小于薯蓣皂甙元的溶解浓度时才能近似认为全部被提取出来。本文采用ASE200萃取的方法提取薯蓣皂甙元，具有快速、所需溶剂较少的优点。
3. 根据文献报导检测样品时酸解的浓度为1M硫酸溶液[1]、1.25 M硫酸溶液[7]、2M盐酸溶液[2，4]，但在实际操作时，通过工艺中薯蓣皂甙元收率的计算发现检测时没有酸解完全，所以决定参考生产工艺提高硫酸的浓度为2.0M，通过对比数据可以看出2M硫酸溶液酸解较好，并且通过薯蓣皂甙元生产工艺收率验证了酸解完全。
4. 整个工艺中的烘干黄姜、除去淀粉和纤维素黄姜、酸解后已烘干部分、成品部分及提取后废渣等部分都需要检测皂甙元的含量。酸解后已烘干样品、废渣样品根据具体工艺需要而决定是否要酸解；成品样品可直接用流动相溶解，在HPLC上检测，用面积归一化法计算含量。从图1中的色谱图可以看出本方法在检测这几类样品时皂素含量不受样品中其它物质的干扰，检测结果直观、准确的优点，所以本方法适合于薯蓣皂甙元生产全过程的质量检测。
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