激光共聚焦显微镜在耳蜗组织培养中的应用

                    王心蕊 1 王苹2孟召祥3郝黎明 1 王光明1刘明远1*
             1人兽共患病教育部重点实验室，吉林大学人兽共患病研究所
             2吉林大学第一临床医院
             3 吉林省人口生命科学技术研究院

摘要：

    目前对全身应用顺铂所产生的内耳损害规律已经有了相当充分的认识。但对离体培养的耳蜗毛细胞及螺旋神经节神经元细胞在培养基中是否也对顺铂具有类似于在体实验的耳中毒规律尚缺乏足够的了解。为进一步探讨顺铂对毛细胞及螺旋神经节神经元细胞的直接毒性作用，我们应用耳蜗器官培养技术和毛细胞静纤毛荧光染色技术和激光共聚焦显微镜技术，观察顺铂对培养的毛细胞及螺旋神经节神经元细胞的影响，明确顺铂对毛细胞及螺旋神经节神经元细胞的直接毒性作用。本研究结果证明，顺铂对离体培养的大鼠耳蜗毛细胞及螺旋神经节神经元细胞的破坏规律与其全身用药的耳中毒规律既有相似点，也有不同点。顺铂的耳毒性不仅造成毛细胞的丢失和凋亡，螺旋神经节神经元细胞也受累及，而且部分支持细胞也被损害。在体实验中顺铂杀伤毛细胞的特点是最外层毛细胞受损严重，并且具有从高频区域向低频区域发展的趋势。但是离体实验显示的结果与在体不同，毛细胞受损没有区域特异性，而且3层外毛细胞的损伤程度没有明显差别，有趣的是内毛细胞的损伤最重，出现细胞坏死的形态学特征，考虑是由于耳蜗组织在离体培养状态下完全排除了全身健康状况、肾脏功能状态、各种激素水平以及耳蜗膜迷路屏障等多方面因素的影响，因此确定了毛细胞及螺旋神经节神经元细胞对顺铂具有特殊敏感性的机理显然是存在于细胞本身。

    耳蜗组织培养是建立体外实验条件下观察和分析耳蜗组织内各种细胞形态与功能状态的重要手段之一。耳蜗组织培养可模拟某种病理环境，建立细胞水平的损伤模型以供体外研究。我们拟运用激光共聚焦显微镜技术，观察顺铂对培养的毛细胞及螺旋神经节神经元细胞的影响，研究顺铂对毛细胞及螺旋神经节神经元细胞的直接毒性作用。

一材料与方法
耳蜗组织的分离培养：
1、出生3天的Fisher大鼠，70%乙醇消毒，眼科剪断头，剪开颅骨，去掉脑组织，分离颞骨部分，打开听泡，小心分离耳蜗组织，分离螺旋韧带，去除内侧神经纤维。
2、鼠尾胶原支持物的制备：I型鼠尾胶原，10×BME，2% Na2 CO3以9：1：1的比例混匀，取20μl混合物滴于35mm直径的培养皿底，待胶凝固后加１ml培养液。
3、基底膜平铺到预先制备好的胶粒上。次日补加0.5ml的培养液。24小时后加入0.25mM的顺铂培养基，其中一组加入含有DAPI培养基，另一组同时加入NMDA受体抑制剂CNQX。
免疫荧光染色：
    培养24小时后收获培养组织。弃去培养基，用Hank’s溶液洗涤2次，加入4%的多聚甲醛溶液固定。
    1 4%的多聚甲醛溶液固定30 min。
    2 用PBS洗涤3×5min。
    3 0.1% Triton X-100处理15min。
    4 5% goat serum封闭1小时。
    5 加入一抗（1：200），室温孵育1小时。
    6 PBS洗涤3×15min。
    7 加入二抗（1：400），室温避光放置1小时。
    8 PBS洗涤3×15min，轻轻摇动。
    9 盖玻片封片。
观察方法：
    1 将含有DAPI培养基换液后置于LSCM倒置显微镜下进行观察，选择参数如下：Laser Power: 10mw; Scanning 30%;Stage Speed:2.00mm/s; Z-step:0.5um，选数值孔径为1.4的10镜，荧光标记用波长358/461nm,Z轴方向外毛细胞顶部至内毛细胞以0.5um的Z轴步距逐层进行断层扫描，通过SFP(simulated fluorescence process)选项，获取清晰三维图像。图像存为512×512像素类型；2免疫荧光染色后的切片置于LSCM倒置显微镜下进行观察，选择参数如下：Laser Power: 10mw; Scanning 50%;Stage Speed:2.00mm/s; Z-step:0.2um，选数值孔径为1.4的20镜，荧光标记用波长543/580nm,Z轴方向外毛细胞顶部至内毛细胞以0.5um的Z轴步距逐层进行断层扫描，通过SFP(simulated fluorescence process)选项，获取清晰三维图像。图像存为512×512像素类型；
二 结果
1不同培养基对培养耳蜗毛细胞和神经元生长的影响
    我们采用丁大连等[1]建立的耳蜗基底膜体外培养技术，将基底膜贴附在鼠尾胶表面，鼠尾胶不仅可作为器官培养支架，而且可以自由通透药物和细胞养分，有利于耳蜗组织存活。在这个实验中我们比较了不同培养基对培养的耳蜗器官中毛细胞和螺旋神经元存活的影响。结果显示，使用含胰岛素样生长因子的培养基非常适合毛细胞生长，对培养7天的耳蜗基底膜进行F-actin染色，发现大部分毛细胞仍旧有正常的纤毛结构。采用含有N2-supplement的DMEM/F-12培养基培养耳蜗组织，培养7天后的神经元数目与培养1天的神经元数目没有明显减少，说明不同的培养基成分对耳蜗组织中的不同类型的细胞生长有一定的影响。见附图1-1。
2顺铂对体外培养的耳蜗毛细胞的损害
    与在体实验不同，顺铂对培养的耳蜗毛细胞的损伤没有频率特异性，毛细胞缺失可出现在整个基底膜，正常对照组耳蜗毛细胞形态正常，其3排外毛细胞和1排内毛细胞排列整齐，结构清晰，无缺失。各回毛细胞出现细胞境界模糊或消失，底回损伤明显，而且在3排外毛细胞中以第1排外毛细胞损伤为重，缺失明显，第2排、第3排均有不同程度的缺失，内毛细胞也有丢失。见附图1-2附图1-3、附图1-4。
3顺铂对螺旋神经节神经元细胞的毒性作用
    采用神经丝蛋白抗体标记耳蜗神经元，发现顺铂作用24小时后耳蜗神经元细胞体变小，失去正常形态，放射状神经纤维出现blebbing， 而且神经元数目较正常组明显减少。由于顺铂可导致内毛细胞的严重损害，我们推测耳蜗神经元的死亡可能与内毛细胞受损时产生大量的谷氨酸盐有关。采用谷氨酸盐受体抑制剂－CNQX与顺铂同时作用耳蜗基底膜，结果显示，该组的神经元损伤程度与单纯顺铂组没有明显差别，提示顺铂对体外培养耳蜗神经元的损伤作用可能是顺铂对神经元的直接毒性。见附图1-5。
三 讨论
    目前对全身应用顺铂所产生的内耳损害规律已经有了相当充分的认识[2]。但对离体培养的耳蜗毛细胞及螺旋神经节神经元细胞在培养基中是否也对顺铂具有类似于在体实验的耳中毒规律尚缺乏足够的了解。本研究应用耳蜗器官培养技术和毛细胞静纤毛荧光染色技术和激光共聚焦显微镜技术，体外耳蜗组织培养的实验研究避免了如体内各种激素水平、肾功能状态、原有疾病情况和个体差异等全身因素的干扰和影响，使实验条件更加纯化。在明确的单纯因素改变下的变化机理，使研究途径更为便捷可靠。
    哺乳类动物的耳蜗是由高度分化的稳定细胞群体所组成，这种高分化的稳定细胞群体具有恒定的DNA总量而通常不再具有分裂增殖的能力，因此内耳器官的离体培养相对于其它组织的培养技术而言具有更高的要求和难度。迄今为止，内耳器官在离体培养条件下的存活时间仍以天数为计时单位而无法做到像其它某些较低级分化组织的继代培养那样理论上可以在培养基中获得永生，因此本研究所采用的耳蜗器官培养技术是一种原代培养方法。本实验成功地在培养基中模拟了顺铂所引起的耳蜗毛细胞及螺旋神经节神经元细胞的损害模型，为进一步应用细胞培养技术探讨顺铂耳中毒机理和探索针对病因而制订相应的有效防治耳聋的手段提供了实验模型和参考经验，耳蜗器官培养方法可以适用于各种耳毒性药物的离体培养实验，尤其在验证针对损害原因所采取的保护措施是否有效等方面，具有简便、直接、可靠、省时和节约等优点。
    耳蜗Cortis’器由多种细胞组成，内外毛细胞不在同一层面，支持细胞交织在内外毛细胞之间，选用常规的方法难以观察和对比。我们采用激光共聚焦显微镜活体观察耳蜗组织毛细胞的变化，荧光标记用波长358/461nm,Z轴方向外毛细胞顶部至内毛细胞以0.5um的Z轴步距逐层进行断层扫描，通过SFP(simulated fluorescence process)选项，获取清晰三维图像。通过三维立体结构图像重建，使形态学更为客观；激光共聚焦显微镜与耳蜗组织培养有机结合，避免了由于耳蜗组织较厚和细胞层次较多，有助于研究细胞的形态结构及功能及和细胞间的相互作用及组织分化，内耳器官培养可以研究内耳发育的机理，影响内耳发育的因素，各种耳毒性药物，放射线等对内耳发育的危害，以及先天性内耳畸形的原因。成体哺乳动物耳蜗螺旋神经节神经元体外培养的方法扩大了内耳组织培养的材料来源，为外周听觉系统离体研究工作的开展提供了新的手段。
    本研究结果证明，顺铂对离体培养的大鼠耳蜗毛细胞及螺旋神经节神经元细胞的破坏规律与其全身用药的耳中毒规律既有相似点，也有不同点[3]。顺铂的耳毒性不仅造成毛细胞的丢失和凋亡，螺旋神经节神经元细胞也受累及，而且部分支持细胞也被损害。在体实验中顺铂杀伤毛细胞的特点是最外层毛细胞受损严重，并且具有从高频区域向低频区域发展的趋势。但是离体实验显示的结果与在体不同，毛细胞受损没有区域特异性，而且3层外毛细胞的损伤程度没有明显差别，Chen等[4]直接向鼓阶灌注N-甲基-D-天冬氨酸盐（NMDA），过度刺激耳蜗内NMDA受体，导致NO释放，可产生明显的病理学改变。本实验使用NMDA受体抑制剂-CNQX与顺铂共同作用耳蜗基底膜，发现CNQX并没有维持耳蜗神经元存活的作用。提示离体条件下，继发毛细胞损伤后的谷氨酸释放，兴奋性毒性增强，不是顺铂耳蜗神经毒性的主要机制，可能还有其他细胞凋亡途径参与。

 参考文献：
1． Dalian D, Alfred S, Richard JS. Leupept in protects cochlear and vestibular hair cells from gentamicin ototoxicity. Hear Res, 2002,164:115-126.
2． Sockalingam R, Filippich L, Charles B, et al. Cisplatin-induced ototosicity and pharmacokinelics: preliminary findings in a dog model. Ann Otol Rhinol laryngol, 2002,111(8):745-750
3． Ramirez-Camacho R, Garcia-Berrocal JR, Trinidad A et al, Central role of supporting cells in cochlear homeostasis and pathology. Med Hypotheses. 2006;67(3):550-5.
4． Chen C, Nenov A, Skellett R, et al. Nitroprusside suppresses cochlea potentials and outer hair cell response. Hear Res, 1995,87(1):1-8.