聚羟基脂肪酸酯支架材料制作中的扫描电镜应用

                            林月娟1 张泰星2李晓涛3*
               1 汕头大学分析测试中心，广东 汕头 515063

               2 汕头大学理学院生物系，广东 汕头 515063
               3 汕头大学多学科研究中心，广东 汕头 515063

摘要：
    本文利用扫描电镜观察和分析三种不同方法制作的聚羟基脂肪酸酯（PHA）支架材料。在扫描电镜观察下，马来酸化的Ma-PHBHHx通过溶剂浇铸法制成的膜基质材料具有独特的螺纹结构；应用热致两相法制作的PHBHHx支架则比PLA支架具有更大的孔隙度。同时，通过扫描电镜的检测发现了具有纳米纤维网状结构的PHA新型支架材料，这种通过溶剂处理法获得的PHA纳米纤维支架与细胞外基质（ECM）的主要成份胶原蛋白的结构非常类似，它的纤维直径平均大小在80-350 nm 之间。

关键词：组织工程；生物支架；聚羟基脂肪酸酯；聚羟基丁酸酯；扫描电镜

Abstract：This paper is presented the observation of three kind. of Polyhydroxyalkanoates (PHA) matrices by SEM. The maleated PHBHHx (Ma-PHBHHx) made by solution casting method was shown unique whorle-like structure; PHBHHx scaffold, which was prepared by thermally induced phase separation (TIPS), had improved pore-size compared with that of PLA scaffold. The results revealed that a nano-fibrous matrix made of PHA materials had been formed through unique solution process, the nano-fibrous matrix is similar to the structure of collagen, which is the main component of extracellular matrix (ECM), and its average diameter of the fiber is ranged 80～350 nm.

Key words: Tissue engineering, Scaffold, Polyhydroxyalkanoates (PHA), Poly R-3-hydroxybutyrate (PHB), Scanning electron microscope (SEM).

一、引言
    聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates，PHA）是一类通过微生物发酵技术在生物体内天然合成的聚酯高分子材料[1]。这些年来PHA材料在组织工程上的应用得到了广泛的研究[2，3]。聚羟基丁酸酯（Poly R-3-hydroxybutyrate，PHB）是PHA中最典型的均聚物，具有很高的结晶度[4，5]，已经开发应用于手术缝合线[6]、神经修复[7]、药物运输系统[8]和软组织修复[9]的临床实验中。最近，美国Tepha公司开发的基于 PHB材料的TephaFLEX®®可吸收缝合线产品已经获得美国食品与药品管理局(FDA)的上市批准。为了克服PHB的脆性和加工的可塑性[10-12]，人们开发了PHA的共聚物PHBV、PHBHHx以及P3HB4HB材料[13]。这些新一代的PHA材料表现出良好的生物降解性和生物相容性，以及比PHB更好的机械强度[3, 14]。
    另一方面，利用PHA材料模拟天然的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）特性，促进细胞的体外贴附、生长、增殖、分化以及新组织的形成[17]，同样引起了人们浓厚的兴趣。人们采用盐析法[18]、纺织法[19]、相分离法[20，21]和自组装法[22]等不同的工艺手段制备各种各样的细胞生长基质材料。通过电子扫描显微镜的检测，人们发现这些人造的生物支架都具有存在一定孔隙的空间结构。因而，通过电镜观察法设计生物支架正在成为当今组织工程领域中最令人关注的焦点之一[22，32]。

二、材料和方法
1、材料
    PHB (Mw: 1,020 kDa)：购于中国江苏省南天股份有限公司；PHBHHx （Mw：270 kDa，12% 3HHx）由清华大学微生物实验室友情赠送；其它药品均为分析纯试剂。

2、制作方法
2.1 PHA膜基质材料的制备
    马来酸化的Ma-PHBHHx 1.0g溶于50ml氯仿中， 加热温度60℃ 持续1.0小时，所得的溶液倾倒在120mm培养皿，置于室温蒸发一天，然后置于冰干机(Modulyo D-230, Thermo, USA)48小时。溶剂充分蒸发之后得到厚度约200μm的膜基质材料[26]。
2.2 PLA、PHBHHx支架材料的制备
    PLA、PHBHHx各0.5g分别溶于20ml 1,4-二氧六环中，加热至80℃并不断搅拌持续30分钟，使材料充分溶解。所得的澄清溶液倒进50ml 敞口烧杯后迅速转移至液氮中孵育30分钟，然后置冰干机(Modulyo D-230, Thermo, USA)里冷冻干燥48小时，除去溶剂，得到多孔支架[24, 25]。
2.3 PHA纳米纤维基质材料的制备
    1.0 g PHB溶于50ml 60℃氯仿中，得到澄清溶液后，每10ml溶液中加入2.5 ml二氧六环。所得的混合溶液超声20min，然后置于4℃冰箱20小时，使溶液变成凝胶。用水浸泡凝胶一天并换水三次。凝胶去掉水后在-80℃冰箱冷冻1小时，再置于冰干机(Modulyo D-230, Thermo, USA)冻干48小时。

3、电子扫描显微镜观察和分析
    将得到的PHA基质材料裱在铝桩上表面，置于JFC-1600离子溅射仪中以10mA电流的条件下喷镀铂金1.5min，使PHA基质材料表面镀上一层铂膜。然后放到扫描电子显微镜(SEM, JSM-6360LA, JEOL, Japan)下观察。在观察膜和PLA、PHBHHx支架材料的表面形态结构时，先设置15 kv的加速电压，发现扫描时间较长或放大倍数较大时，被观察的样品表面会受电子束的损伤。通过实验证明，为使PHA基质材料尽量不受电子束的损伤并保证图像的高清晰质量，观察纳米级纤维样品时采用7kv的扫描电压，其它样品采用10kv扫描电压；束斑直径为30～35？？nm 单位！！？？之间。

三、结果与讨论
    PHA，尤其是PHB、PHBV、PHBHHx和P3HB4HB，在体内外的生物降解性与生物相容性都得到了国内外相关文献的有力证明[1-3]，PHA在医学组织工程上的应用日益成为生物塑料发展的焦点之一[2-3, 14]。在这些材料进入临床应用之前，我们还必须考虑生物相容性问题，即很多这样的生物材料都显示出一定的生物相容性，但与真实的细胞外基质（ECM）微环境相比较，这些人工的植入材料在结构和性质上还是有很大的差别[3, 17]。而扫描电镜作为一种精密的显微仪器，可以对各种基质材料的结构进行精确的扫描和分析。因此，欲制作理想的植入材料，以促进生物医学组织工程的不断发展，扫描电镜必将扮演重要的角色[23]。本文利用扫描电镜观察了三种不同方法制备的PHA生物可降解支架材料，分析了这些支架材料的特性，结果如图1和图2所示。
    应用溶液浇铸法制备膜基质材料是高分子中常用的方法之一[23]，而基质膜的表面形态结构是在进行细胞培养时影响细胞生长状况的决定因素之一。在检验基质膜的生物相容性之前，往往需要通过扫描电镜来分析材料表面的拓扑结构。图1a和图1b显示，通过扫描电镜观察，经过马来酸酐处理过的Ma-PHBHHx材料所制成的膜要比用PLA制作的膜粗糙得多，图1c可以清楚地看到Ma-PHBHHx制成的膜表面具有很多螺纹结构。这种独特的螺纹结构主要是由于马来酸酐基团的引入增强了PHBHHx分子间相互作用力，例如氢键作用的原因[21, 26]。此外，L929 和 HMVC两种细胞系的培养实验表明，这种具有螺纹结构的膜基质有利于提高细胞的黏附性和增殖能力[26]。
    在组织工程上利用热致相分离法（TIPS）制备多孔支架材料是比较常用的方法之一[25]。然而，TIPS制备的支架往往具备较小的孔隙，导致支架的孔隙率并不高[24]。在应用TIPS法制备PHA支架的过程中，图2 c和图2d中的PHBHHx支架的平均孔径大小达到500 μm左右，与图2a和图2b用相同方法制备的PLA支架相比，在孔径大小上具有很大的改进。这种多孔的三维支架为细胞提供了更多的生长空间，有利于细胞更好地生长分裂[25]。
    胶原蛋白，作为细胞外基质(ECM)的最主要成分之一，是由50nm到500nm大小的纳米级纤维构成的三维网络结构物质[27，28]。随着组织工程的快速发展，人造基质也越来越接近天然的ECM结构。张曙光等人利用电荷互补的短肽链进行“生命自组装”，制造出直径大小为10 20nm的纳米级纤维支架[29]。由这些蛋白多肽自组装形成的纳米纤维支架可对动物细胞进行三维形态上的培养，已有报道的培养细胞包括造骨细胞、海马神经元细胞和成年鼠神经干细胞等[30]。Ma PX等人用PLLA材料成功地制备了纳米纤维支架[31]，并用于骨组织工程的修复，体外实验结果表明具有显著的修复效率[32]。在我多学科研究中心实验室的研究中，利用生物合成的可降解PHA材料，图3是通过溶剂处理法首次制备了一系列的纳米级纤维支架材料，通过扫描电镜的观察，这些PHA材料具有连续的三维网状结构，纤维的平均直径大小在80 350nm之间，跟胶原蛋白的纳米纤维结构非常类似。更有意义的是，由PHA制成的纳米纤维材料的机械强度可以通过改变中等链长的PHA含量而得到调节。这种创新的PHA材料克服了由短肽自组装和PLLA材料形成的纳米纤维支架由于机械强度不够而在医学应用上受限制的缺点[22, 32]。初步的细胞培养实验同样表明，PHA纳米纤维材料比一般的没有三维网络结构的PHA支架材料更有利于细胞的生长。

四、总结
    扫描电镜的检测和分析在组织工程生物支架材料的设计中扮演了非常重要的角色。通过使用扫描电镜的分析，我们成功地制备了在组织工程上具有潜在应用价值的Ma-PHBHHx膜基质、PHBHHx大孔支架以及PHA纳米纤维材料。利用扫描电镜技术，我们检测出这些生物支架材料的内在结构信息，尤其是在纳米级纤维支架材料制作过程显示出其特性。因此，扫描电子显微技术在对生物支架材料的设计具有非常重要的作用，同时，也为未来组织工程和再生医学的研究提供了一种有效的方法。

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Figures and legends
Figure 1 SEM study of maleated PHBHHx (Ma-PHBHHx) film. The film was made of Ma-PHBHHx materials through solution casting method. a. PLA film, ×500; b. Ma-PHBHHx film, ×500; c. Ma-PHBHHx film, ×1，000. Note that Ma-PHBHHx film was shown a little rougher with whorl-like structures compared with smooth PLA film．

Figure 2 SEM study of PLA and PHBHHx scaffold. They were both prepared by thermally induced phase separation (TIPS) methods. a. PLA scaffold, ×500; b. PLA scaffold, ×1,000; c. PHBHHx scaffold, ×300; d. PHBHHx scaffold, ×2,000. Note that the pore size of PHBHHx scaffold was improved significantly compared with that of PLA scaffold

Figure 3 SEM study of PHA nano-fibrous matrix. The matrix was prepared from 2% (wt/v) PHB chloroform solution with some dioxane addition, and treated with sonication for 20 min. a. ×2,000; b. ×5,000; c. ×10,000. Note that the matrix treated with sonication were shown homogeneous and the fiber diameters had small sizes of 80~350 nm.