激光扫描共聚焦显微镜精确测量有机包裹体气液比方法研究

                        王存武1.2 邹华耀2 刘建章1 姜丽娜2
(1中国地质大学资源学院石油系，湖北武汉 430074；2中国石油大学石油与天然气成藏机理教育部重点实验室，北京102249)

摘要 利用激光扫描共聚焦显微镜并结合三维重建软件可以精确获取有机包裹体的气液比。有机包裹体气泡部分采用透射光通道进行系列深度扫描，选取气泡直径最大处的扫描图象进行直径测量，并利用球体体积计算公式得到气泡体积，避免了由于油包裹体液相石油所发出的强烈荧光的遮挡造成的气泡体积偏小；将共聚焦扫描图象进行三维重建获取精确的有机包裹体总体积，与计算所得的气泡体积共同确定出有机包裹体的气液比。利用该方法对渤海湾盆地渤中凹陷BZ25-1-3井的一块流体包裹体样品的气液比进行了研究，测试的气液比为6.85％。精确获取有机包裹体的气液比不仅能为包裹体PVT性质的研究提供精确参数，还对流体包裹体微观性质的对比研究提供了借鉴，具有重要意义。

0 前言
    近些年来，激光扫描共聚焦显微镜（Laser Confocal Scanning Microscope，简称LCSM）已广泛应用于细胞生物学、细胞生理学、神经生物学和神经生理学等几乎所有设计涉及细胞研究的现代医学和生物研究领域[1,2]。激光扫描共聚焦显微镜具有高灵敏度和能观察空间结构的独特优点，从而对被检样品从停留在表面、单层、静态局面的观察进展到立体、断层扫描、动态全面的观察，已成为生命科学研究领域的新一代强有力的研究工具[2]。
    然而，激光扫描共聚焦显微镜在地质领域尤其是油气勘探领域中的应用才刚刚起步[3-7]。Aplin[8]最早报道了将激光扫描共聚焦显微镜用于精确获取烃类包裹体的气液比，并将获取的这一参数应用于流体包裹体古压力求取的研究，取得了较好的效果，使得古流体压力定量计算的精度有了较大飞跃。在此之后，Liu[9]、Thiéry[10]、Teinturier[11]等学者均运用激光扫描共聚焦显微镜精确获取了烃类包裹体的气液比，结合PVTsim软件获取了古流体压力，并将结果应用于油气运移和成藏方面的研究。但如何精确获取烃类包裹体的气液比仍然存在一些问题：烃类包裹体受激光照射时液体部分发出较强荧光，会使气泡部分被照亮，从而使测试的气液比偏小；由于有机包裹体形态的不规则性，利用圆台体积公式计算气液体积比时通常会产生系统误差。本文作者利用中国石油大学（北京）最新引进的Olympus FV1000型激光扫描共聚焦显微镜进行了一系列实验研究，提出了一种利用LCSM测试烃类包裹体气液比的新方法，极大提高了测量精度。
1原理
1.1激光扫描共聚焦显微镜工作原理
    激光扫描共聚焦显微镜是以激光作为光源，通过激光孔及物镜的聚焦作用形成一个光点照射到样品上激发出荧光的一种光学显微镜。该系统主要包括激光光源、自动显微镜、扫描模块(包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜!检测器)、数字信号处理器、计算机以及图象输出设备(显示器!彩色打印机)等。物镜的质量决定了共聚焦光学切片及图像的质量，有自发荧光或可被荧光染料标记的样品被激光激发而发出荧光通过光学路经达到光电倍增管(PMT)，PMT可以检测出发射光的波长及长度。其光学系统采用照明点和探测点共轭这一特殊结构，使分辨率和成像的质量大大提高。激光光点通过一个特殊的双面反射镜的移动以完成扫描样品的过程，同时在光学路径中PMT前方安装了孔径可调的共聚焦点孔，可使任何非焦平面反射来的光线被阻挡在PMT之外，不能参与图像的形成,使得共聚焦图像比一般荧光显微镜的图像的清晰度大大提高,取得更好的图像效果[12]。
1.2 有机包裹体气液比测试原理
    有机包裹体在受到紫外光、紫光、蓝光或激光照射时会在极短的时间内发射出比照射光波长更的光,这种光称为有机包裹体的荧光[13]。这是因为，当有机分子受到这些短波长的光照射时,有机分子中原来处于基态的电子受到激发而跃迁到较高的能级轨道上，跃迁后处于激发态的电子通过发射出相应的光量子释放能量回到基态,就发射出荧光。利用这一原理，将有机包裹体薄片置于激光扫描共聚焦显微镜下，确定出有机包裹体的顶底界后进行“Z”轴扫描，得到不同深度的系列切片。利用三维重建软件对这些切片进行三维重建，获取整个包裹体的体积，同时获取油包裹体中气泡部分的最大直径，并按球体计算出气泡体积，从而可以获取有机包裹体的气液比。
2 方法
    本研究使用的是中国石油大学（北京）最新引进的OLYMPUS FV1000型共聚焦显微镜，主要由激光照射系统、扫描检测系统、全自动正置荧光显微镜系统、计算机系统及相关软件等组成。配有FV10扫描单元，具有三荧光通道，采用多线氩离子激光光源可以产生458nm、488nm和514nm波成的激光，功率为20mW，显微镜水平（x-y）分辨率约是0.2μm，垂向分辨率可达0.1μm。显微镜系统为OLYMPUS BX61型正置显微镜，配备60X高分辨率油镜（数值孔径为1.42）。
    实验样品为渤海湾盆地渤中凹陷将流体包裹体双面剖光岩石薄片置于激光扫描共聚焦显微镜的载物台上，在紫外光照射下寻找可用于测试的气液两相有机包裹体，之后将待测样品置于60X油镜下进行激光扫描图像的获取，由于液体部分发荧光而气体部分不发荧光从而使二者明显的区分开来。之后，在激光扫描显微镜计算机控制软件FV10-ASW1.5中，设置待扫描有机包裹体的顶底界（既向上移动电动平台时有机包裹体荧光消失时的深度为顶界，向下移动电动平台时荧光消失时的深度为底界），设置垂向采样间隔为0.1μm，采用深度扫描模式进行扫描，并使用透射光和荧光双通道扫描，获取垂向系列二维切片（如图所示）。将获取的系列二维图片在商业化图像处理软件IPP（Image-Pro Plus 5.1）中打开，利用该软件的三维重建功能进行三维图像的重建。
3 结果
    图1展示了部分扫描图象，随着扫描深度的增加，流体包裹体图象经历了由小变大再变小的过程，气泡只在前32张图片中存在。由于气泡部分部发荧光，但如果烃类包裹体液相部分的荧光较强，就会部分掩盖气泡，使观测和计算的气液比偏小。因此，本研究首先在透射光通道的图象中确定气泡部分的直径（原则上是选择系列扫描图象中直径最大时的图象进行测量）。因为气泡部分在自然状态下是球形或十分接近的球形，故可根据球形体积计算公式进行计算，得到气泡体积。有机包裹体的总体积是IPP软件三维重建时自动计算得到的。
    据此，我们可根据测量或计算得到的气泡体积和液相石油的体积计算气液比，结果如表1所示。
4 结论
    通过激光扫描共聚焦显微镜进行有机包裹体气液比的精确测量，可以得到如下认识：
    1、由于有机包裹体气泡部分常常受到液相部分较强的荧光的影响，用激光扫描图象直接恢复气液比会使结果偏小，因此采用透射光通道扫描图象先进行气泡直径的测量，将其当做标准球体利用球体体积计算公式进行气泡体积的计算，使气液比结果更为可靠；
    2、将有机包裹体扫描图象进行三维重建，可以得到精确的总体积数据，结合已计算的气泡体积便可精确获取有机包裹体的气液比，其精度是目前最高的。
    3、该方法测试的有机包裹体气液比时需选取个体较大、形态规则并且气泡部分较明显的包裹体。

参考文献
[1] 朱珊珊, 黄志江. 激光扫描共聚焦显微镜在生命科学研究中的应用. 国外医学. 2005, 26(2): 118~119
[2] 陈燕, 宋健, 汪浩等. 共聚焦扫描显微镜对厚样本光学断层及其三维重建. 解剖学杂志, 2005, 28(2): 188~192
[3] 王金星. 共聚焦显微扫描系统的新方法在地质科学研究中的应用. 地质论评, 2004, 50(2): 215~217
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[7] 孙先达, 索丽敏, 张民志等. 激光共聚焦扫描显微检测技术在大庆探区储层分析研究中的新发展. 岩石学报, 2005, 21(5): 1479~1488
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[9] D.H. Liu, X.M. Xiao, J.K. Mi, et. al., Determination of trapping pressure and temperature of petroleum inclusions using PVT simulation software—a case study of Lower Ordovician carbonates from the Lunnan Low Uplift, Tarim Basin. Marine and Petroleum Geology, 2003(20): 29–43
[10] R. Thiéry, J. Pironon, F. Walgenwitz et al., Individual characterization of petroleum fluid inclusions (composition and P–T trapping conditions) by microthermometry and confocal laser scanning microscopy: inferences from applied thermodynamics of oils. Marine and Petroleum Geology 19 (2002) 847–859
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[12] 张旭, 俆维奇. 激光扫描共聚焦显微镜技术的发展及应用. 现代科学仪器, 2001, 2: 21~23
[13] 叶松, 张文淮, 张志坚. 有机包裹体荧光显微分析技术简介. 地质科技情报, 1998, 17(2): 76~80