激光共聚焦显微镜在耳科学研究中的应用

                      孙建和 胡吟燕 翟所强 韩东一 杨伟炎
           解放军总医院耳鼻咽喉研究所,耳鼻咽喉头颈外科 北京 100853

    激光扫描共焦显微镜(Laser scanning confocal microscope，LSCM )加上众多的荧光燃料分子的应用，为生命科学开拓了一条观察生命活细胞的结构和特定分子、离子生物学变化的新途径。LSCM可用于对任何细胞结构（生物膜、细胞器、染色体等）及分子（核酸、蛋白质、脂类等）、离子（Ca2+,K+,H+等）进行定位、定量、实时、动态的观测。国内耳科研究人员利用LSCM对内耳组织进行了广泛地研究和观察，取得了满意的研究结果。
    一、荧光标记技术与LSCM在耳蜗Corti器研究中的应用
    LSCM可直接、无创性地对组织进行连续光学切片, 观察同一标本表面和内部结构。为探索LSCM 在内耳形态学研究领域的应用前景, 应用LSCM 结合免疫荧光组织化学双标记技术, 孔维佳等观察了5只豚鼠耳蜗毛细胞及支持细胞上部构像。通过毒伞素标记毛细胞肌动蛋白纤维, 以抗角质蛋白单克隆抗体标记支持细胞。在LSCM 下可清楚观察到毛细胞静纤毛、表皮板以及毛细胞顶部无表皮板区; 可同时观察到外柱细胞头板、Deiter 细胞指状突顶板以及位于网状层下方的Deiter 细胞指状突。LSCM 为研究Co rt i 器形态增加了一种新的手段[1]。
    用fluo-3/fura-red 荧光比值作细胞内游离钙指标,用LSCM测定豚鼠耳蜗分离的内、外毛细胞及外指细胞的游离钙, 并利用钙成像技术进行细胞形态计量。单个外毛细胞呈试管状。内毛细胞呈烧瓶状, 有明显的颈部。外指细胞分为体部及指状突部。毛细胞的胞内游离钙浓度明显高于外指细胞。毛细胞的胞质、胞核及表皮板的游离钙浓度不同。外指细胞的细胞体与指状突的游离钙浓度也不同。通过观察发现有无颈部为区别分离的内、外毛细胞的重要标准, 外指细胞可凭借其特异的指状突结构以资识别。内耳毛细胞及外指细胞胞内游离钙分布的不均一性可能与各部位生理功能不同有关[2]。
    二、耳蜗内毛细胞游离钙测量
    应用LSCM和荧光染料Fluo-3染色观察谷氨酸对豚鼠耳蜗内毛细胞内游离钙浓度的影响，发现内毛细胞的钙成像完好，细胞呈烧瓶状，瓶颈状结构清晰，细胞核呈圆形。经染色的内毛细胞可以存活2h左右。Fluo-3染色使内毛细胞轮廓清晰可见，胞核着色较深，使细胞核呈很亮的黄色。不加谷氨酸时细胞呈均匀一致的钙显色分布，给予3.85μM谷氨酸，内毛细胞内钙的浓度明显增加，而外毛细胞内的钙浓度却没有明显的变化。给予谷氨酸180s后, 内毛细胞的钙浓度增加达到高峰，给予谷氨酸400s以后内毛细胞的钙浓度逐渐下降。观察10个内毛细胞，其中有9个内毛细胞的钙浓度增加，只有1个内毛细胞没有发现内毛细胞的浓度有变化。观察10个外毛细胞其中7外毛细胞没有发现浓度有变化，三个外毛细胞见外毛细胞内钙的浓度有轻微的下降。给予内毛细胞谷氨酸后使细胞内钙浓度增加的结果提示谷氨酸是以正反馈方式作用于内毛细胞突触前受体的[3]。
    如果预先给予特异性N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体抑制剂D-α-氨基磷酸基戊酸（D-AP5）终浓度为50 μmol/ L后，再加谷氨酸观察其对游离内毛细胞的作用。结果发现给予D-AP5后，再加3.85μM谷氨酸并不引起内毛细胞内钙的浓度增加。而按同样方式预先给予同样浓度特异性α-氨基-3-羟基-4异恶唑-丙酸（AMPA）抑制剂6-氰基-7-硝基喹喔啉-2，3-二酮（CNQX)后，观察到内毛细胞内钙浓度增加。由此可以得知内毛细胞膜上的谷氨酸受体主要是NMDA型的，不是AMPA型受体。外源性谷氨酸可以通过正反馈方式作用于内毛细胞膜上的自身受体来增加内毛细胞的钙浓度[4]。
    三、耳蜗外毛细胞游离钙测量和钙信号转导的研究
    为探讨毛细胞胞内钙库的种类, 作者又观察了在无钠、无钙和含镧液体中, 在不受胞外Ca2+内流和质膜上Ca2+转运机制影响的条件下,和在三磷酸肌醇敏感钙库工具药thap sigargin 和ryanodine 敏感钙库工具药caffeine 作用下, 毛细胞胞内游离钙( [Ca2+ ]i) 的变化过程。分离的豚鼠耳蜗外毛细胞(outer hair cell , OHC)经钙敏荧光染料 5?mol/L fluo-3 染色后, 用LSC监测, 以fluo-3 荧光相对值指示毛细胞[Ca2+ ]i 的高低。30 nmol/L thapsigargin 使外毛细胞[Ca2+]i 由静态值1.0 增至1.64±0.76, 再加入10mmol/L caffeine 后更增至2. 45±1.59。Q 值检验示两种试剂引起外毛细胞[Ca2+]i 增高程度的差别有极显著意义, 表明毛细胞内有对三磷酸肌醇敏感和对ryanodine 敏感两种钙库参与了胞内Ca2+释放机制[6]。
    豚鼠耳蜗外毛细胞L 型钙通道经DM-BODIPYDHP 和RH414 标记后用LSCM,以DM-BODIPYDHP / RH414 荧光比值大小指示L 型钙通道密度的高低。观察耳蜗2～4 圈OHC L 型钙通道分布密度。结果发现应用硝苯地平阻断后,质膜的DM-BODIPYDHP 荧光染色明显减弱,表明其钙通道为特异性L 型钙通道;L 型钙通道密度从低频区(第4圈) 向高频区(第2圈) 有逐渐增加的趋势,方差分析示第4圈和第2圈OHC 之间 L 型钙通道的分布差异有显著性意义; OHC 质膜不同区域L 型钙通道分布差异无显著性意义。由此可以看出耳蜗2～4圈OHC 之间L 型钙通道分布的差异可能是耳蜗音位分布图的分子机制之一[7]。
    应用LSCM和fluo - 3/ fura-red 双重荧光标记法, 研究豚鼠耳蜗分离OHC钙信号转导及其与细胞能动性的关系。OHC受药物或机械刺激后,其钙信号起源于一侧质膜, 可形成钙波传向全细胞, 对其中1 个OHC 测得传播速度为0.025-0.047μm/ s 。钙信号转导过程中各亚细胞区域游离钙浓度增加幅度不同。胞内游离钙增高时伴有细胞长度变化,缩短者占6/ 10 ,伸长者占4/ 10。对照组(不予刺激且胞内游离钙无变化者) 3 个OHC中,缩短者2 个,长度无变化者1 个。实验表明,听毛细胞受刺激后可产生钙波,钙信号具有不均匀性, OHC的钙依赖慢运动表现为细胞伸长,细胞缩短则在胞内游离钙浓度升高或保持于静态基准浓度时均可发生[8]。
　 肖自安等选用豚鼠15 只处死,Hanks 液中分离活性单离OHC ,Fluo-3/AM 负载30 min。分7 组进行不同干预,包括乙酰胆碱(ACH ,胆碱能M 和N 受体兴奋剂) 、毒蕈碱(M 受体兴奋剂) 、阿托品(M 受体拮抗剂) 、庆大霉素(N 受体拮抗剂) 、加Hanks 液对照组和不加干预对照组;另1 组为dHanks液中加ACh。用LSCM (Bio-Rad ,英国) 观察OHC 内[Ca2+]i的变化。探索胆碱能兴奋剂和拮抗剂对豚鼠耳蜗单离OHC 内游离钙浓度[Ca2+]i的影响,和OHC 内[Ca2+]i的胆碱能调控机制。结果发现Hanks 液中不加干预试剂、加毒蕈碱、加Hanks 液对照和无钙dHanks 液中加ACh 等4 组, [Ca2+]i在25～30 min 内升幅 < 1.10 倍。Hanks 液中加ACh 组[Ca2+]i最高升幅平均为3.09 倍;阿托品+ ACh 组[Ca2+]i为2.92 倍;庆大霉素+ ACh 组[Ca2+]i为1.81 倍。由此得出结论豚鼠耳蜗传出神经递质ACh 通过兴奋N 受体,开放OHC 的细胞膜钙离子通道,使细胞外Ca2+ 内流OHC内; [Ca2+]i增加需要细胞外液中钙离子存在[9]。
    四、前庭器官毛细胞的观察
    用胶原酶消化后机械分离豚鼠前庭毛细胞,钙敏荧光探针Fluo-3 染色, 用LSCM记录前庭毛细胞的钙荧光图像及细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i) 的动态变化。观察胆碱能受体激动剂对离体前庭毛细胞内钙离子浓度的影响,探讨前庭毛细胞膜所存在的胆碱能受体分型及庆大霉素对钙离子通道的阻断作用。结果发现胆碱能M 和 N 型受体激动剂乙酰胆碱(ACh)、氨甲酰胆碱(CCh) 均可引起离体前庭毛细胞内[Ca2+]i 的升高;N 型受体激动剂溴化乙酰胆碱(Ach-Br) 仅在高浓度(10 mmol/L ) 时引起部分(4/5 个) 离体前庭毛细胞内[Ca2+]i升高,在低浓度(1 mmol/L ) 时影响不明显;而阿托品对ACh、CCh 引起的前庭毛细胞内[Ca2+]i的升高有抑制作用; 加入0.1 mmol/L 阿托品可使1 mmol/L ACh 或CCh 引起的前庭毛细胞内[Ca2+]i升高的峰值明显减小(P < 0. 01) ;加0. 1 mmol/L ACh 引起前庭毛细胞内[Ca2+]i升高之后, 再加入0.5 mmol/L 庆大霉素, 前庭毛细胞内[Ca2+]i出现显著下降, 至低于静息时的水平。　由此可以得知豚鼠壶腹嵴前庭毛细胞膜上存在M型和N 型两种受体,M 型受体激动剂引起前庭毛细胞内[Ca2+]i 的升高较N 型明显。阿托品对M 型受体激动剂引起的[Ca2+]i升高有抑制作用; 庆大霉素对前庭毛细胞膜的钙离子通道可能有阻滞作用[10]。
　 五、耳蜗螺旋神经节的观察
　 用LSCM以Fluo-3/AM负载后的豚鼠螺旋神经节细胞(SGC) 为实验对象,观察碱性成纤维细胞生长因子( bFGF)对其钙调控的影响以及这种影响与硫酸链霉素的拮抗效应。发现高钾细胞外液和含1nmol/ L bFGF的正常细胞外液灌流可以导致SGC[Ca2+]i明显升高,钙升高的来源为细胞外钙离子的内流,bFGF和高钾细胞外液具有协同作用,硫酸链霉素可以阻断高钾细胞外液的致细胞内钙升高效应,bFGF可以拮抗硫酸链霉素的这种阻断作用,拮抗作用的大小与所用bFGF的浓度相关[12]。
综上所述，LSCM结合荧光探针技术可以测定生理和病理条件下内耳前庭、耳蜗螺旋神经节和毛细胞内[Ca2+]i及其变化，为在细胞水平上研究平衡和听觉的生理病理机制提供了新的手段。

参考文献
1 孔维佳, Dolan D. F., Rapharl Y., Nuttall A. L. 激光扫描共焦显微镜在内耳形态学研究中的应用. 中华耳鼻咽喉科杂志,1996 ;31 (4):22-23
2 苏振伦,孙燕荣,李　楠,路庆国,姜泗长.豚鼠耳蜗内毛细胞、外毛细胞及外指细胞钙成像. 中国组织化学与细胞化学杂志.1999;8(2):165-168
3 Xingqi Li , jianhe Sun, Ning Yu, Yanrong Sun, Zulin Tan,Sichang Jiang, Nan Li, Chunxi Zhou. Glutamate Induced Modulation of Free Ca2+ in Isolated Inner Hair Cells of the Guinea Pig Cochlea. Hearing Research 2001, 161; 29-34
4 Li Xingqi, Sun Jianhe, Yu Ning. D-AP5 blocks the increase of intracellular free Ca2+ induced by glutamate in isolated cochlear IHCs. Chinese Medical Journal 2002;115(1):89-93
5 苏振伦　孙燕荣　姜泗长. 耳蜗外毛细胞两种胞内钙库的初步探讨.神经解剖学杂志. 2001;17(4):342-344
6 郭 英,苏振伦,杨伟炎,姜泗长. 豚鼠耳蜗各回外毛细胞L 型钙通道的分布. 中华耳鼻咽喉科杂志.2002;37(5):321-323
7 苏振伦,孙燕荣,李 楠,路庆国,姜泗长. 听毛细胞钙信号转导及其与细胞能动性的关系. 生物物理学报.1998;14(4):684-688
8 肖自安,谢鼎华,伍伟景,杨 曙,杨 川. 豚鼠耳蜗单离外毛细胞游离钙的胆碱能调控. 听力学及言语疾病杂志.2002;10(4):244-246
9 韩维举,张素珍,韩东一,姜泗长,杨伟炎. 胆碱能激动剂引起的前庭毛细胞内钙离子浓度升高及庆大霉素对它的影响.中华航空航天医学杂志.2001;12(1):26-30
10 李树华,曹玉华,韩东一,杨伟炎. 碱性成纤维细胞生长因子对硫酸链霉素急性耳毒性影响的实验研究.解放军医学杂志.2003;28(5):28-430