环孢素A致人肾小管上皮细胞损伤初步观察

                            军事医学科学院毒物药物研究所
                                    周建平　袁本利

    CsA对肾脏慢性损伤最重要的是肾小管不可逆损伤。通过观察CsA对HK-2细胞系的直接影响，为进一步阐明CsA的慢性肾毒作用提供参考。前期工作发现，CsA致大鼠慢性肾毒性模型中，用免疫组化的方法没有检测到iNOS表达，为了观察iNOs的表达情况，我们设计了一组细胞中加入LPS刺激iNOS的表达，来观察CsA对肾脏NO的作用机制。

　　材料和方法
    人肾小管上皮细胞株（HK-2）在本室细胞培养室培养。环孢素A(CsA) 购自瑞士诺华制药有限公司。二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC），L－硝基精氨酸甲酯（L-NAME）均购自Sigma公司。CsA溶于橄榄油，过滤除菌。LNAME 和PDTC分别溶于PBS，过滤除菌。
    HK-2细胞株在含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液37℃培养，细胞贴壁生长，每2～3d换液1次。待细胞进入对数生长期，用0.25%的胰酶消化，调整细胞浓度为1×109•L-1，转种于25mL培养瓶或者预先放入了盖玻片的12孔培养板。24h换液1次，待细胞将要爬满整个培养瓶或培养板时加入药物作用24h。分组如下：
    正常对照组：培养液不加入药物。
    CsA组：CsA加入细胞培养液，终浓度分别为0.1、1、10mmol•L－1。
    CsA+LNAME组：在培养液CsA三种浓度下分别加入LNAME，使其终浓度为1mmol•L－1。
    CsA＋PDTC组：在培养液CsA三种浓度下分别加入PDTC，使其终浓度为25µmol•L－1。
    CsA＋LPS组：在培养液CsA三种浓度下分别加入LPS，使其终浓度为1mg•L－1。
    LNAME组：培养液加入LNAME，终浓度为1mmol•L－1。
    PDTC组：培养液加入PDTC，终浓度为25µmol•L－1。
    LPS组：培养液加入LPS，终浓度为1 mg•L－1。
    半定量数据采用单向有序的R×C表的秩和检验。

　　结果
一. Hoechst 33342染色法荧光显微镜观察细胞凋亡
    处理的细胞经Hoechst 33342 染色后，荧光显微镜下发现凋亡的细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒状或块状荧光，细胞膜和核膜完整，细胞核浓聚深染，典型的还可见核的固缩和新月形改变，并可见凋亡小体。正常细胞的细胞核呈弥散均匀荧光。坏死细胞虽然也可见浓染的致密颗粒状荧光，但细胞器肿胀破裂，细胞崩解成碎片。
    正常对照组、LNAME组和PDTC组细胞大部分呈现均匀分散的荧光，凋亡指数分别为：1.5％、1.8％、0.9％。
    CsA组各浓度可见到较多的凋亡细胞，0.1、1、10 mmol•L-1三个浓度组的凋亡指数分别为28.6％、29.4%、24.3%。
    CsA+LNAME组也可见到较多的凋亡细胞，0.1、1、10 mmol•L-1三个浓度组的凋亡指数分别为29.2％、37.6％、30.5％，同时也可见到较多的崩解的细胞碎片。
    CsA＋PDTC组凋亡细胞较CsA组和CsA+LNAME组少但较对照组多，0.1、1、10 mmol•L-1三个浓度组的凋亡指数分别为4.3％、10.7％、15.3％。
二. TGF β1，NF-κB蛋白免疫荧光染色结果
    正常对照组、LNAME组和PDTC组TGF β1，NF-κB蛋白免疫荧光染色没有或者有很弱的荧光，数量少，无规律性的散在分布，结果为阴性和弱阳性。
    CsA组和CsA+LNAME组在CsA浓度为0.1mmol•L-1时TGF β1，NF-κB蛋白表达均为阳性，其中TGF β1 主要在细胞质，而NF-κB蛋白则见于整个细胞。随着CsA浓度的增加，其荧光强度也增强，表达的细胞数量也增加。
    CsA＋PDTC组各浓度下有很弱的荧光，数量较CsA组和CsA+LNAME组少，散在分布，结果为弱阳性表达。
三. 流式细胞术测线粒体膜电位的变化
    Rh123是线粒体的特异性染料，具有膜通透性和亲脂性，能被活细胞摄取并堆积在线粒体中。由于凋亡和死亡细胞线粒体受损，Rh123摄取较少，因而荧光较弱，而功能正常的细胞荧光较强。
    正常对照组、LNAME组和PDTC组及CsA＋PDTC组荧光强度较强。CsA组和CsA+LNAME组与对照组比较荧光强度降低, 线粒体膜电位降低。而CsA＋LNAME组荧光强度降低更加明显，且都与CsA浓度相关，与对照组比较有显著差别（P＜0.05 ）。
四. 激光扫描共聚焦显微镜检测NF-κB的表达
    细胞在静息状态下NF-κB的P65亚基与NF-κB抑制蛋白（IκB）－一种抑制蛋白结合而处于无活性状态，存在于细胞质中。当细胞受到刺激因素的刺激时，IκB磷酸化并随之降解，NF-κB活化进入细胞核，从而发挥其作用。在肾脏的肾小球系膜细胞、肾小球上皮细胞、肾小管上皮细胞等均存在NF-κB的调控，与肾脏疾病关系十分密切。利用激光扫描共聚焦显微镜在不同波长的扫描下分别显示出细胞质和细胞核中NF-κB的表达情况，利用激光扫描共聚焦显微镜的共定位技术又可以看到二者的合成图像，较传统的检测NF-κB的方法EMSA相比，操作简单，且能够显示单个细胞NF-κB活化状态。
    因用RNase A酶处理细胞，故PI仅标记DNA，指示为细胞核区显红色。FITC标记的二抗显绿色, 整个细胞呈现绿色荧光表示NF-κB被激活。在激光扫描共聚焦显微镜不同波长的扫描下分别显示出两种图像，利用共定位技术可以看到红色和绿色荧光的合成图像，重叠部分呈现桔黄色荧光。
    正常对照组、LNAME组和PDTC组仅细胞质呈绿色。合成图像，重叠部分未呈现桔黄色荧光，说明NF-κB未被激活。CsA组和CsA+LNAME组中当CsA为0.1 mmol•L－1时整个细胞的绿色荧光较弱，但仍可见到细胞核区呈较浅的绿色。合成图像，重叠部分呈现较弱的桔黄色荧光。当CsA为1和10 mmol•L－1时整个细胞呈现绿色, 合成图像，重叠部分呈现桔黄色荧光，表明NF-κB被激活，但两组之间未见有明显的差别。CsA＋PDTC组仅胞浆呈绿色。合成图像，重叠部分未呈现桔黄色荧光表明NF-κB未被激活，与CsA组和CsA+LNAME组差别明显。
五. Western Blot 检测iNOS的表达变化
    正常对照组、LNAME组和PDTC组iNOs的表达较低，而CsA组随着CsA浓度的增加iNOs的表达更低较正常对照组有明显差异（P＜0.05）。 用LPS刺激细胞后iNOs表达增强，表现为LPS组iNOs的表达明显增强。而加入CsA后则明显降低了LPS导致的iNOs表达，且随着CsA浓度的增加，这种抑制作用更明显表现为CsA＋LPS组iNOs表达的减弱，与LPS组比较有明显的差异（P＜0.05）。