反相高效液相色谱中缓冲体系PH值的选择
 

  在反相高效液相色谱分析中,选择正确的缓冲液PH值,对可离解的化合物分析的重现性十分重要,不恰当的PH值可能导致不对称峰,宽峰,分裂峰或肩峰,而尖锐的,对称的峰是定量分析中获得低的检测限以,两次分析之间较低的相对标准偏差(RSD)和保留时间的高重现性的前提。我们将讨论在使用缓冲液时如何选择缓冲液的PH值,以及如何选择正确的缓冲体系。

什么时候需要缓冲溶液?
在反相液相色谱分析中,流动相的PH值一般在2.5-7之间,当被分析物在反相条件下可离解,或样品的PH值在2.5-7之外时,就需要缓冲液。在反相条件下可离解的化合物一般都有氨基和羧基,他们的Pka在1-11之间,选择正确的缓冲液PH值可保证可离解的官能团以一种形式存在,离子形式或中性化合物的形式。如果样品的PH值对柱子有伤害,则缓冲溶液可使其变温和从而减小其危害。

如何选择缓冲液PH值
在选择缓冲液PH值之前,应先了解被分析物的Pka,高于或低于Pka两个PH值单位的,有助于获得好的、尖锐的峰,从HH公式:PH=Pka+log([A-]/[A])得知,溶液PH值高于或低于Pka两个单位,化合物中99%以一种形式存在,而一种形式存在的化合物才能获得好的尖锐的峰。

让我们通过一个例子来看如何选择PH值
例如苯甲酸图(一)
图(一)
显示的是它的离子形式和中性化合物的转变,苯甲酸的Pka等于4.2,理论上由HH公示得知,当溶液PH值等于2.2时,99%的苯甲酸以中性化合物存在,PH值等于6.2时99%的苯甲酸以离子形式存在,所以当缓冲液PH值等于2.2时,中性化合物以羧酸形式保留于反相柱,表1列出了一般缓冲液和他们的缓冲范围。从表1知磷酸盐和柠檬酸盐缓冲液能用于PH值等于2.2。
表1
Phosphate
Pka12.11.1-3.1
Pka27.26.2-8.2
Pka312.311.3-13.3
Citrate
Pka13.12.1-4.1
Pka24.73.7-5.7
Pka35.44.4-6.4
Formate3.82.8-4.8
Acetate4.83.8-5.8
Tris(hydroxymethyl)aminomethane8.37.3-9.3
ammonia9.28.2-10.2
borate9.28.2-10.2
diethylamine10.59.5-11.5

当化合物只有氨基时,缓冲体系的选择十分简单,大多数氨基化合物在PH值小于9时都被质子化,所以所有PH值在7或更低的溶液均适合应用,你也许会问水的PH值大约是7,为什么还用缓冲盐,因为缓冲盐有助于增加方法的可靠性,以及色谱峰的尖锐性,PH值的降低有助于氨基化合物保留的减弱,减小化合物与硅胶表面硅羟基的作用,而使峰更尖锐,从表1 可值,任何缓冲液均可应用于氨基化合物的分析,但我们认为PH值等于3的磷酸钾盐最适合用于氨基化合物的分析。
在上面两个例子中,PH=3的磷酸钾盐都能获得良好的应用,在一般情况下,它是含羧基和氨基化合物分析中最好的缓冲液,并且我们认为在氨基化合物分析中钾盐比钠盐更好。

为离子对试剂选择缓冲液
为应用离子对试剂的方法选择缓冲液的过程是相似的,离子对试剂例如四丁基铵的盐,十四烷基磺酸钠等,在流动相中可与化合物中可离解的官能团配对,在缓冲液中以离子形式存在的化合物就需要应用离子对试剂。

应用缓冲液PH值来调节方法选择性
如前面提到的,氨基化合物的保留随PH的减小而降低,这个特性可以用来调节方法的选择性,如果两个化合物共流出,一个含有氨基,适当改变PH值就可以用来分离这一物质对。由于可离解化合物的选择性依靠PH值,所以变化PH值也可以用来鉴别未知化合物的官能团,如果PH值变小,出峰便快,则化合物中可能存在氨基,当PH变大,化合物出峰很快,或流出在死时间处,化合物可能是一种羧酸,因为羧基离子化后流出大大快于比质子化的中性化合物。

总结
正确选择缓冲溶液在反相液相色谱方法中对于优化尖峰,捡出限,以及获得稳定的保留时间十分重要,如果你知道化合物官能团信息和化合物的Pka值这一过程将十分简单。

 




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