HPLC在高纯度大豆异黄酮制备研究中的应用

                 聂保振1,2 李琴1 王谢1 侯登科1 雷天乾1 张书胜1

             1.郑州大学化学系, 郑州 450052; 2.焦作市化工技校, 焦作

    常见的单组分大豆异黄酮包括大豆苷(Daidzin)、染料木苷（Genistin）、黄豆苷（Glycitin）及其甙元形式。关于单组分大豆异黄酮的制备，国内外报道较少，国外一般使用制备液相色谱法制备，但设备昂贵，成本较高，无法实现工业化[1-7]。高纯度的单组分大豆异黄酮可以用作标准品以及药理研究，另外还可以用来制备大豆异黄酮衍生物，随着对大豆异黄酮研究的不断深入，大豆异黄酮衍生物的价值也逐渐被人们所认识。研究建立了大豆异黄酮的HPLC分析方法，利用HPLC方法，对聚酰胺和硅胶柱层析吸附法分离纯化大豆异黄酮进行了比较。

    大豆异黄酮粗品（自制）；聚酰胺（柱层析用, 中国医药上海化学试剂有限公司）；硅胶（柱层析用, 上海五四试剂厂）；高效液相色谱仪（FL2200,福立分析仪器有限公司）。本实验采用溶剂洗脱来分离纯化大豆异黄酮。洗脱的原则: 用溶剂从浓度（极性）大小冲洗柱子，因吸附剂孔径大小不同使分子量大小不同的物质滞留于洗脱液中或吸附剂中，然后用水冲洗去除杂质 。

    经过优化实验，确定了以Phenomen,Kromasil 5μC18柱( 150×4.6 mm; ID×5μm)为分离柱，以甲醇:乙腈:0.5%醋酸水溶液=22.5:7.5:70(v/v/v) 为流动相，流速为1.0 ml/ min ,检测波长254 nm为最佳色谱条件. 进标样得混合标准物质色谱图（图略）。在上述色谱条件下进行HPLC分析，以相应的峰面积A对浓度C线性回归方程分别为：大豆苷：A=18733C +1112.7(N=5,R= 0.9996)；黄豆苷:A=6113C- 66.2(N=5, R= 0.9999)染料木苷:A=9257C +1123 (N=5,R= 0.9998)。三种异黄酮苷最低检出限分别40ng/ ml,15ng/ml，25ng/ml。

    经过聚酰胺吸附的洗脱液浓缩后，杂质明显减少，糖苷形式被水洗去，30%、60%、95%的乙醇溶液洗脱可得到不同成分的单体，洗脱液经HPLC检测，保留时间7.388min为大豆苷(D) ，其纯度达到了87.21%；保留时间8.455min应为黄豆苷(Gly)，其含量纯度已达到了97.54%；保留时间12.288min为染料木苷(G)，含量可以达到90.53%。

    经过硅胶的吸附，当用甲醇做洗脱剂时，得到了更高含量的大豆异黄酮苷，其他的非异黄酮杂质几乎全被除去，尤其是黄豆苷的含量有了明显的提高。7.414min为大豆苷；8.310min为黄豆苷；13.909min为染料木苷，如下图所示。

参考文献

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