璃/PDMS复合微流控芯片用于单胺类
                    神经递质的快速分析

                         黄勇 李向堂 石明 赵书林*
                 广西师范大学化学化工学院 桂林 541004

    多巴胺(dopamine,DA)和肾上腺素(epinephrine,E)是重要的单胺类神经递质,在人体的心血管系统、神经系统、内分泌腺、肾脏、平滑肌等组织系统的生理活动、学习记忆、心血管活动和脑循环中起着广泛的调节作用。研究人体液中多巴胺和肾上腺素及其测定方法，对于临床医学和生理学研究有着重要的实际意义。
    芯片毛细管电泳作为一种新的微分析技术,自20世纪90年代初提出以来,以其高速、高效、样品耗量少,自动化和集成化等特点,广泛应用于于化学、生物学、医学等领域分析中。在芯片毛细管电泳中,单胺类神经递质的分离和测定，主要采用玻璃芯片、PDMS/PDMS芯片，检测方法有电化学检测[1],及发光二极管激光诱导荧光检测[2]。
    本文采用自制的玻璃/PDMS复合芯片,以异硫氰酸酯荧光素（FITC）衍生单胺,用473 nm的半导体激光器为激发光源，在微流控芯片共聚焦激光诱导荧光检测系统上，对DA和E进行了分离检测。在优化的实验条件和有效分离长度为5.5 cm的芯片上，120 s内实现了DA和E的快速分离。应用于人尿液中 DA和E的同时测定，结果满意。

1．仪器与试剂
    QL—2000型微流控芯片/激光诱导荧光检测仪（山东师范大学产品)，配473nm半导体激光器。光路为共聚焦型设计,荧光信号经过滤光片后由PMT收集转变为电信号,由HW-2000色谱工作站记录.
    SG4009匀胶铬板(长沙韶光微电子总公司);Sylgard 184型PDMS预聚体及固化剂(Dow Corning Corp.,USA);异硫氰酸酯荧光素( FITC ),多巴胺盐酸盐,肾上腺素,胍基丁胺,氨基酸购购于Sigma公司,十二烷基硫酸纳（SDS）为上海化学试剂厂进口分装,其余试剂为国产分析纯。铬刻蚀液(硝酸铈铵 +高氯酸);玻璃刻蚀液(1 mol/L HF + 1 mol/L NH4F)；实验用水为Milli-Q的去离子水。
2．玻璃/PDMS复合芯片的制作
    玻璃基片参考文献[3]的制作方法。将SG4009匀胶铬板在强紫外光源下曝光,然后进行显影、刻蚀、除膜,得到带有通道的玻璃基片。PDMS盖片的制作:将PDMS预聚物及固化剂以质量比为10∶1的比例混合均匀,脱气后,小心把混合物浇注于玻璃模具中,在80℃烘箱中聚合2 h,脱模后,裁成与基片大小一致的PDMS片,并在相应位置打3.5 mm孔作为贮液池,即可得到PDMS盖片。PDMS盖片放在254nm紫外灯下照射2 h后，1 min内与基片贴合并放置24h,即得到玻璃/PDMS复合芯片。
3．样品衍生
    取适量的DA和E标准品溶解于pH 9.2的20 mmol/L硼砂缓冲溶液中配成1.7 mmol/L的DA和1.3 mmol/L的E储备液。各取2 μL标准溶液于0.5 mL的离心管中,加入60 μL 2.0×10-3 mol/L FITC丙酮溶液,再加入20 mmol/L(pH 9.2)的硼砂缓冲溶液至100 μL,室温下避光反应14 h。电泳前,用分离缓冲稀释至所需要的浓度。

4．芯片电泳
    电泳前分别用1 mol/L、1 mol/L NaOH、去离子水冲洗芯片通道 30 min。每次电泳间则依次用0.1 mol/L NaOH、去离子水、运行缓冲溶液冲洗10 min。在各个储液池中,分别加满分离缓冲和样品溶液,采用悬浮方式进样,在样品储液池（S）上加500 V电压, 样品废液池（SW）接地,同时缓冲液池（B）和缓冲废液池（BW）悬空,进样 30 s。分离时,在B中加1800 V分离电压,BW接地,同时S和SW加1080 V反拉电压,在离十字交叉处下游 5.5 cm 处进行激光诱导荧光检测。电泳前,缓冲溶液和样品溶液均需用 0.45 μm 的滤膜过滤。
5. 分离条件
     综合考虑各种因素后,实验确定了分离FITC-DA和FITC-E的最佳条件为:运行缓冲溶液为含有50 mmol/L SDS 的 20 mmol/L 硼砂缓冲溶液(pH 10.0),分离电压为1800 V。在最佳分离条件下,对2.6×10-7 mol/L FITC-DA 和 2.0×10-7 mol/L FITC-E 的分离结果见图1。

6．工作曲线、线性范围和检出限
   在实验条件下，荧光强度（峰高）与E和DA的浓度，分别在8.0×10-8～4.0×10-5 mol/L和1.0×10-7～6.0×10-5 mol/L范围内，呈现良好的线性关系。根据S/N＝3，计算得E和DA检测限分别为9.0×10-9 mol/L和4.0×10-8 mol/L。

7．样品分析
    对人尿液中的DA和E的含量进行了测定。结果表明，成年人尿液中DA和E的含量，分别在0.79～1.1×10-7 mol/L 和9.8～11.1×10-7 mol/L范围内。图2和图3分别为成年人尿，及在成年人尿试液中标准加入9.0×10-7 mol/L E 和 5.0×10-7 mol/L DA.后的电泳分离图。

参考文献
[1] Zeng Y, Chen H, Cheng J K, et al. Anal.Chem, 2002, 74:244
[2] Li H F, Cai Z W, Lin J M. Anal.Chim.Acta, 2006, 565:183
[3] 殷学锋,沈宏,方肇伦.分析化学,2003,31:116
感谢国家自然科学基金(No 20665002)和教育部科学研究重点项目(206113)资助, *通讯联系人。