高效液相色谱-蒸发光散射检测法
                测定艾宁颗粒中黄芪甲苷的含量
                           丁家欣，张秋海 
             (中国中医科学院中医基础理论研究所，北京100700)

摘 要：建立了高效液相色谱蒸发光散射检测法测定艾宁颗粒中黄芪甲苷含量的方法。以甲醇提取，水饱和正丁醇萃取，D101大孔吸附树脂纯化的方法处理样品，色谱柱为Hypersil-Keystone C18；流动相为乙腈-水（33：67）；流速是1mL/min；漂移管温度105℃ ，空气流速2.7 L/min。黄芪甲苷的线性范围为1.135.65 µg，平均回收率为96.24%，RSD为2.02%。该方法重复性好，专属性强，准确可靠，可用于艾宁颗粒的质量控制方法。
关键词：高效液相色谱蒸发光散射检测法；黄芪甲苷；艾宁颗粒

Determination of the content of Astragaloside Ⅳ in Aining Keli By HPLC-ELSD
                       DING Jia-xin, ZHANG Qiu-hai
(Institute of Chinese Medicine Basic Theory, China Academy of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100700, China)

Abstract  A method for determination of Astragaloside Ⅳ in Aining Keli by high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector (HPLC-ELSD) was established. Samples were extracted with methanol; further extracted with water-saturated n-butanol ; chromatographed on D101 macroporous resin. A Hypersil-Keystone C18 column was used with the mobile phase consisting of acetonitrile-water (33∶67). The flow rate was 1.0 mL/min. The parameters of drift tube and gas flow rate of the detector were set at 105℃ and 2.7L/min respectively. The linear range of Astragaloside Ⅳ was 1.13~5.65 µg. The average recovery of Astragaloside Ⅳ was 96.24%, with RSD=2.02%. This method was proved to be repeatable, specific, accurate and can be applied in the determination of Astragaloside Ⅳ in Aining Keli
Key words: HPLC-ELSD; Astragaloside Ⅳ; Aining Keli

    艾宁颗粒是我所在进行公益课题“中医药治疗艾滋病”的研究中，以中医理论为指导，从辨证论治的角度，在临床预试验基础上研制出的中药制剂。由黄芪、人参、麦冬等十一味中药组成，具有益气养阴，补益肺脾的功能，用于气阴两虚，乏力低热，自汗盗汗，纳差腹泻，咳嗽消瘦等症状为主的早中期艾滋病患者。其中黄芪为本方君药，具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌的功效[1]。主要成分为皂苷、黄酮及多糖，从黄芪中共分离出四十余种三萜皂苷，通常以黄芪甲苷作为检查黄芪是否存在的对照品。黄芪甲苷的检测方法已有许多报道，主要有薄层扫描法[2]、高效液相色谱紫外检测法[3]、高效液相色谱示差折光检测法[4]、高效液相色谱蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD）[5]等。本文采用HPLC-ELSD对艾宁颗粒中的黄芪甲苷进行含量测定，旨在建立艾宁颗粒的质量控制方法。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂：
    美国HP1100高效液相色谱仪（G1311A四元泵，G1313A自动进样器，G1316A柱温箱， HP化学工作站）；美国Alltech 2000蒸发光散射检测器；天津市分析仪器厂 XWK-III无油无音空气泵。乙腈、甲醇为色谱纯；正丁醇，乙醇分析纯，水为重蒸水。黄芪甲苷（C41H68O14）对照品由中国药品生物制品检定所提供（批号 0781-200109）。三批艾宁颗粒均由中国中医科学院中医基础理论研究所中药质量分析实验室提供 （批号030605；030606；030607 ）。
1.2 色谱条件
    色谱柱：Hypersil-Keystone C18 （250×4.6mm 5μm）；流动相：乙腈-水（33:67）；流速：1mL/min；蒸发光散射检测器参数：漂移管温度105℃ ，空气流速2.7 L/min，理论板数按黄芪甲苷峰计不低于5000。
1.3 样品处理
    精密称取艾宁颗粒约2g，研细，置索氏提取器中，加甲醇40 ml，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流提取4小时，提取液回收甲醇并浓缩至干，残渣加水10 ml微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20 ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次20 ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水3-5 ml使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径1.5cm，长12 cm），以水50 ml洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30 ml洗脱，弃去40%乙醇洗脱液，继用70%乙醇50 ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至2 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
1.4对照品溶液的制备
    精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.226mg的溶液，即得。

2．结果与讨论
2.1 流动相的选择
    参照《中国药典》2005年一部黄芪含量测定项下的条件。选择色谱条件为乙腈-水（33：67） 分离效果好，而与其它成分无干扰。流速：1.0ml/min 柱温：35℃ 理论板数按黄芪甲苷计应不低于7000。
2.2 漂移管温度和气体流速的选择
    参照Alltech ELSD 2000用户使用手册推荐，漂移管温度和气体流速计算方法，结合观察漂移管温度对基线噪音的影响和气体流速对响应值的影响，设定漂移管温度为105℃，气体流速为2.7L/min。
2.3正丁醇萃取次数的考察
    本试验用水饱和的正丁醇萃取黄芪甲苷，对萃取次数进行了3、4、5次的考察，将萃取第3、4、5次的正丁醇液蒸干，分别用甲醇定容于1ml量瓶中，在所确定的条件下测定，结果第3次的萃取液在黄芪甲苷的色谱峰位置处无峰，故将萃取次数定为3次。
2.4 D101大孔树脂洗脱体积的考察
    参照药典洗脱液为水洗脱-40%乙醇洗脱-70%乙醇洗脱的方法试验。柱体积约为20ml，将水洗脱液每管接收20ml，蒸干，以甲醇定容至1ml量瓶中，在所确定的条件下测定，结果黄芪甲苷的色谱峰位置处无峰，第3号管已无杂质峰，因此确定水洗脱体积为50ml；将40%乙醇洗脱液体积每管接收20ml，蒸干，以甲醇定容至1ml量瓶中，在所确定的条件下测定，结果黄芪甲苷的色谱峰位置处无峰，第2号管已无杂质峰， 因此确定40%乙醇的洗脱体积为30ml。将70%乙醇洗脱液每管接收20ml，蒸干，以甲醇定容至1ml量瓶中，在所确定的条件下测定，结果第3号管黄芪甲苷的色谱峰位置处无峰，因此确定70%乙醇洗脱体积为50ml。
2.5．线性关系考察
    取干燥至恒重的黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.226mg的溶液。精密吸取5，10，15，20，25μl，注入液相色谱仪中，测定峰面积，以对照品进样量的自然对数为横坐标，以对照品峰面积的自然对数为纵坐标，绘制标准曲线。其线性范围为1.13~5.65μg，回归方程为： Y=1.5159X+4.7291 r=0.9995 。
2.6．稳定性试验
    精密吸取同一供试品溶液（批号030605）10μl，分别于制备后0、1、2、4、6、24小时依次进样，测得黄芪甲苷峰面积相对标准偏差RSD=2.02％。试验结果表明，供试品溶液在24小时内基本稳定。
2.7．精密度试验
    精密吸取同一供试品溶液（批号030605）10μl，在所确定的HPLC条件下，重复进样5次，求得黄芪甲苷峰面积相对标准偏差RSD=1.72％。
2.8．重复性试验
    取同一批样品（批号030605）按1.3样品处理方法制成5份供试品溶液，在所确定的HPLC条件下进行测定。相对标准偏差RSD=1.01％，说明方法重复性良好。
2.9．回收率试验
    采用加样回收法，精密称取已知含量同一批号（批号030605，含黄芪甲苷0.2144mg/g）的样品1g，分别精密加入黄芪甲苷对照品溶液0.22mg/ml各1ml，按1.3样品处理方法制备及上述色谱条件测定，结果见表1。

3 样品测定结果
    利用建立的样品处理方法和HPLC-ELSD测定方法测定三批艾宁颗粒中黄芪甲苷的含量，结果见表2。

参考文献：
[1] 国家药典委员会. 中国药典，一部[S]. 北京：化学工业出版社，2005：212
[2] 常增荣，张小茜，周富荣. 薄层扫描法测定黄芪及制剂中黄芪甲苷的含量[J]. 中国中药杂志，1995，20（8）：482-483
[3] 阎汝南，王静竹，刘舒平，等. HPLC法测定黄芪中黄芪甲苷的含量[J]. 中国中药杂志，1998，23（7）：398-399
[4] 池玉梅，郑泉. HPLC示差折光检测法测定黄芪中黄芪甲苷的含量[J]. 中药材，2000，23（7）：396-397
[5] 赵灵芝，朱丹妮，严永清. HPLC-ELSD法测定黄芪中黄芪甲苷的含量[J]. 药物分析杂志，1999，19（6）：403-405