牛血红蛋白印迹聚合物的研究
                           于爽 王蕾 耿利娜 罗爱芹*
                  北京理工大学生命科学与技术学院 北京 100081

    分子印迹技术（MIT）由抗原抗体的概念发展而来，是一种针对某种特定物质也即模板分子制备对它专一性识别聚合物的人工合成技术。制备的分子聚合物（MIP）在立体空间构型上与模板分子互补。按照MIP与模板之间作用力的类型，可以分为共价型和非共价型。由于共价键作用一般较强，造成传质速度慢，难达热力学平衡，因此目前非共价型更为广泛应用。非共价型主要利用氢键、静电引力、金属螯合作用、电荷转移、疏水作用以及范德华力等[1]，而以氢键应用最多。就分离对象而言，小分子物质的研究比较广泛[2－4]，反应体系多在容易形成氢键等作用力的有机溶剂中；而对于像蛋白质这样的生物大分子，由于其分子量较大，且其高级结构在有机溶剂中极易发生改变，使得蛋白质分子印迹技术发展得比较慢。然而，简便、迅速的生物大分子分离、纯化与检测技术的开发迫在眉睫，它直接影响着人类生物医学水平的提高。MIT又刚好具备简便迅速的特点，因此，不断改变条件，寻求合适有效的方法制备蛋白质的MIP，是十分有潜力并且有意义的。
    在本实验中，主要采用了凝胶法[5－7]制备了牛血红蛋白的分子印迹聚合物，以磷酸盐水溶液反应体系，丙烯酰胺为主要单体，合成MIP后，对其各种特性用不同方法进行了表征。结果表明，该法制备的分子印迹聚合物对牛血红蛋白具有比较好的选择性吸附效果。

实验部分
    首先配制pH为6.2的磷酸盐缓冲溶液，加入牛血红蛋白模板分子，溶解后依次加入过硫酸铵和丙烯酰胺，晃动使其充分溶解，再加N，N＇-亚甲基双丙烯酰胺（MBA），由于它比较难溶，可将盛装反应物的烧杯放入超声仪中超声数分钟使其溶解，同时，超声的过程中可以除去反应液中的氧气，就有利于聚合反应的进行，因为氧气的存在会使自由基淬灭，影响聚合。此时将烧杯口用封口膜封好，再继续超声十分钟，使单体和交联剂正确地排列于模板分子的周围，以使制备的MIP对模板分子有专一的选择吸附性。超声过后，加入四甲基乙二胺，溶液立刻聚合成红色胶体物质。放置2小时以上使充分聚合后进行下一步处理。以上反应过程均在室温下进行。
    将聚合物挤过60目筛，使破碎成小颗粒，有助于模板分子从聚合物中被洗脱出来。然后将颗粒状物质溶于300mL 0.01M pH7.0的PBS中，此步操作在磨口锥形瓶中进行，锥形瓶放入摇床振荡，每隔一定时间（如1小时）取样测吸光度，直至吸光度值不再增大，这时说明未聚合上的蛋白已经基本上全部被洗掉，用布氏漏斗抽滤除去PBS，再用真空干燥箱60℃下干燥4h或更久；研磨已经干燥的聚合物为细小颗粒，以含10%SDS的醋酸为洗脱液进行索氏提取，洗掉聚合上的模板蛋白，理论上得到的分子印迹聚合物（MIP）就应该具有与模板蛋白结构互补的孔穴，然后用去离子水、磷酸液反复洗涤，除去醋酸和附着在上面的多肽片段。再次真空干燥、研磨，待用。
    用JSM6700F高解析场发射扫描电镜观察MIP的外貌形态。
    用考马斯亮蓝法做吸附实验。
结果与讨论
    由电镜图我们可以得到结论，经过研磨后的MIP4呈不规则状存在，没有一定的规律。在MIP 颗粒的表面有一些孔的存在，这些孔应该就是分子印迹聚合物特有的识别模板分子的孔。
定义吸附率为α＝C0-C/C0*100%，其中C0为原液蛋白浓度，C为吸附后蛋白溶液浓度。

    由上表所得数据，MIP4不论对于BHb还是对BSA都比其它MIP有更强的吸附效果，说明对于每100mg模板蛋白分子，使用丙烯酰胺的量在16mmol时效果最好。
    但是，我们还可以看到，以BHb为模板制备的MIP，对BHb的吸附效果远远大于对BSA的吸附效果，尽管BSA和BHb在分子量大小和体积大小上十分相近。这充分说明了该方法制备的MIP对于模板分子有特异性吸附。

参考文献
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