一种温度敏感高效亲和色谱填料的制备及其性能研究
                                  王维 戴荣继* 邓玉林
                    北京理工大学生命科学与技术学院，北京，100081

摘要：我们首先将氨丙基硅胶与丙烯酰氯反应使硅胶表面键合上碳碳双键，然后以偶氮二异丁腈(1.0mol%单体)为引发剂，引发N-异丙基丙烯酰胺和N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺在硅胶表面发生共聚，两种单体的摩尔比为97/3。硅胶上固定的共聚物链上的N-琥珀酰氧基团在磷酸缓冲液中被部分水解肝素的氨基取代，从而使其侧链接枝上肝素。最后，主链上残留的N-琥珀酰氧基团被异丙胺取代得以封闭。在不同的温度下对此色谱填料进行测试，不但对凝血酶有较高的亲和作用，而且具有很好的温度敏感特性。
关键词：温度敏感，高效亲和色谱，凝血酶，肝素

    高效亲和色谱（HPAC）兼具高效液相色谱和亲和色谱的优点，相对于常规软胶亲和色谱分离速度大大提高，并可以改善回收产物的纯度和浓度，再加上亲和色谱本身的高选择性，使其逐渐得到研究者的重视和进一步应用。凝血酶是机体凝血系统的天然组分，在临床上应用广泛。本研究以多孔硅胶为基质材料，利用聚N-异丙基丙烯酰胺的温度敏感效应以及肝素与某些蛋白质的亲和作用，制备了一种与凝血酶有特殊亲和作用的温度敏感的HPAC填料，可以用于高效快速的分离纯化凝血酶。
1 实验部分
仪器与试剂
    依利特P230高压恒流泵，DAD230二极管阵列检测器；装柱机（Alltech）。氨丙基硅胶（直径5μm，孔径100Å，Kromasil)；N-异丙基丙烯酰胺（北京偶合科技有限公司）；N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺（Acros）；低分子量肝素钠（Mw.4500，效价114u/mg，北京偶合科技有限公司）；凝血酶（FIB试剂，北京世帝科学仪器公司）；丙烯酰氯、偶氮二异丁腈、异丙胺等均为分析纯试剂。
实验方法
1.2.1 温敏肝素硅胶的制备 首先氨丙基硅胶在二氧六环中，N2保护下与丙烯酰氯冰浴滴加反应1h，然后升至室温反应1h。将丙烯酰化硅胶悬浮于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，N2保护下加入偶氮二异丁腈(1.0mol%单体)，50℃引发10min，然后加入与硅胶等重的N-异丙基丙烯酰胺和N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺（摩尔比为97/3），N2保护下70℃反应12h。部分水解的肝素（300mg肝素/g硅胶）溶于0.2M pH7.0磷酸缓冲液（PBS）中，加入温敏硅胶，室温反应70h。最后将温敏肝素硅胶悬浮于DMF中，加入异丙胺室温反应24h。
1.2.2检测温敏亲和柱的性能 将制备的温敏肝素硅胶在38MPa压力下以匀浆法装150mm×4.6mm(id)不锈钢柱，在不同温度下以纯水和缓冲盐溶液为流动相对苯和氢化可的松的混合物进行分离，以检测其温敏效应。之后用0.01M PBS-0.1M NaCl（pH4.5）缓冲液平衡色谱柱后，将溶于0.02M PBS的凝血酶注入色谱柱，以此平衡液冲洗20min，再将吸附的凝血酶用0.01M PBS-1.0M NaCl（pH7.5）溶液洗脱。
2 结果与讨论
    温敏肝素柱对苯和氢化可的松的混合物分离效果较好，具有温敏效应，它们的保留时间随温度的升高均有不同程度的缩短，流动相为0.01M PBS-1.0M NaCl时苯和氢化可的松的保留时间变化曲线见图1，而在不具有温敏效应的柱子上则保留时间几乎没有变化。

    温敏肝素色谱填料对凝血酶有亲和作用，同时也有温敏作用，因为随着温度的上升，它的保留时间有显著的缩短，色谱图见图2。

参考文献
[1] Hidenori Yamanaka,* Kimihiro Yoshizako, Yoshikatsu Akiyama, Hiroyuki Sota, Yukio Haseg- awa,Yasuro Shinohara, Anal. Chem. 2003, 75, 1658-1663
[2] Rui Zhao, Jia Luo, Dihua Shangguan, Guoquan Liu, Journal of Chromatography B, 816 (2005)175–181