多种兽药残留蛋白芯片检测试剂盒的评价

                  北京出入境检验检疫局技术中心

                   贾磊 张朝晖 云环 李小林

[摘　要] 　本实验对我国自主研制的蛋白芯片检测试剂盒的灵敏度、精密度、准确性以及特异性等性能进行了较全面的评价。通过对猪和鸡组织样品中的磺胺二甲嘧啶、恩诺沙星、链霉素等兽药的检测结果表明:蛋白芯片检测试剂盒与目前实验室常用的确证方法的检测结果有很好的符合率。完全可以满足兽药残留检测筛选方法的要求。蛋白芯片检测试剂盒具有样品处理方法简单、操作便捷、价格便宜，同时还具有一次可检测多种兽药等优点。
[关键词] 　 蛋白芯片;生物芯片;兽药残留检测

    利用生物芯片技术检测食品中兽药残留，是本世纪发展起来的一种新的食品中兽药残留量检测技术。目前, 国内已成功的研制出兽药残留蛋白芯片检测试剂盒。可对动物肝脏、肌肉和牛奶样品中磺胺类总量、磺胺二甲嘧啶、磺胺喹噁啉、恩诺沙星、链霉素、氯霉素等9种兽药残留检测。该试剂盒,除具有灵敏度高、特异性强、检测结果可靠、样品前处理简单,检测方便快速等优点外,还可实现对上述多种兽药同时并行检测的优点,极大地缩短了检测时间,进而提高了检测效率。本文对 蛋白芯片兽药残留检测试剂盒灵敏度、准确性、特异性进行了研究，并与其它方法进行了比较。

⒈材料和方法
1.1仪器
    1.1.1芯片扫描仪，晶芯LUXSCAN 10-B北京博奥生物芯片有限责任公司
    1.1.2样品制备仪晶芯ECOSAMPLER 北京博奥生物芯片有限责任公司
    1.1.3高效液相色谱仪 WATERSA VINE 2690
    1.1.4旋转蒸发仪 EYELA SN1000
    1.1.5离心机 ALLEGRA 64R
    1.1.6均质器IKA-T25
    1.17酶标仪 BENCHMARK

1.2试剂 甲醇和乙腈，色谱纯；
    1.2.1兽药残留蛋白芯片检测试剂盒，北京博奥生物芯片有限责任公司；
    1.2.2 链霉素ELISA试剂盒，荷兰EURO-DIANOSTICA公司；
    1.2.3 链霉素标准品,批号46754-2158 纯度95.8%;氯霉素标准品,批号40302 纯度99.5%;磺胺甲噁唑,含量99. 9%;磺胺二甲嘧啶,批号30829,含量99. 5%; 磺胺甲氧哒嗪批号3168X,含量99.8%; 磺胺二甲氧嘧啶, 批号3119X含量99. 9%; 磺胺甲氧嘧啶 , 批号3119X含量99.9%; 磺胺喹噁啉, 批号45662含量98. 6%;恩诺沙星标准品,批号41008,含量99.5%; 以上均购自德国Rie。 硫酸链霉素及双氢链霉素,含量≥99% , Fluka 公司;环丙沙星,含量≥99% ,B iometical公司。
    1.3样品来源；阴性样品由北京博奥生物芯片有限责任公司提供。
1.4实验方法
    1.4.1兽药兽药残留蛋白芯片检测试剂盒样品处理及监测方法：参照兽药残留蛋白芯片检测试剂盒使用说明书进行。
    1.4.2磺胺二甲嘧啶、恩诺沙星残留确认检测方法参照SN0208-93和农业部第236号公告进行。
    1.4.3链霉素检测方法参照荷兰EURO-DIANOSTICA公司ELISA试剂盒说明书进行。
2实验内容
    2. 1　蛋白芯片试剂盒灵敏度评价
按照中华人民共和国动物及动物源食品中残留物质监控计划（简称：国家残控计划）中所规定的各种兽药残留检测方法，本实验以四种兽药为考察目标，将蛋白芯片法与ELISA和RIA（放射免疫）法等初筛方法进行比较。蛋白芯片的灵敏度以IC50 (零浓度标准溶液荧光信号强度50%所对应的药物浓度)表示。在芯片的不同的点阵上加入不同浓度的标准溶液，重复测定5次.芯片反应完毕后进行图像扫描和数据处理,将校正后的荧光信号强度对各药物浓度作标准曲线,并求出每种药物的IC50。
2. 1. 1　标准曲线溶液的配制：将各种药物对照品(标准品)按实验所需配制成标准溶液。
2. 1. 2　芯片反应：操作方法按兽药残留蛋白芯片检测试剂盒说明书进行。
2. 1. 3　扫描及数据处理：芯片反应完毕后进行图像扫描和数据处理,将校正后的荧光信号强度对各药物浓度作标准曲线,并求出每种药物的IC50见表1。

2. 2蛋白芯片试剂盒精密度评价：
    2.2.1按磺胺二甲嘧啶、链霉素、恩诺沙星、的最高残留限量MRL分别添加0浓度（0MRL）、1倍的MRL（1MRL）、1.5倍的 MRL、（1.5MRL） 2倍的MRL （2MRL）、 4个浓度，每个添加浓度检测8份平行样品。
    2.2.2对蛋白芯片试剂盒片内变异系数进行了测定。结果见表2.

    2. 3蛋白芯片试剂盒特异性评价
2. 3. 1　标准曲线溶液的配制：将各待测药物及对照品按实验所需配制成标准溶液（包括0浓度共6个浓度）
2. 3 . 2　芯片反应：按兽药残留蛋白芯片检测试剂盒说明书进行。
2. 3. 3　扫描及数据处理：芯片反应完毕后进行图像扫描及数据处理,将校正后的荧光信号强度对各对照品溶液药物浓度作标准曲线,并求出每种药物的IC50值,再以芯片检测目标药物交叉反应率为100% ,按以下公式计算其它药物与芯片检测目标药物之间的交叉反应率。 S=y/Z×100%
　　 S：交叉反应率，y：IC50时检测目标药物浓度，Z：IC50时结构类似物的浓度。结果见 表3.

2．4蛋白芯片试剂盒准确度评价
    2.4.1 加标样品的制备：取鸡肉、鸡肝、猪肉、猪肝样品经确认方法未检出磺胺二甲嘧啶、恩诺沙星、链霉素作为阴性样品。取上述阴性样品分别以1.2-2倍最高残留限量MRL的添加浓度，制备阳性样品，添加方法见
表4.

2.4.2取上述阴性样品、阳性样品各个24份，别同时与高效液相色谱和ELISA试剂盒确认方法法进行对比，分析阳性和阴性的符合率。结果见表5。
2.4.3磺胺二甲嘧啶的确认方法按SN0208-93高效液相色谱法进行。
2.4.4链霉素的确认方法按荷兰EURO-DIANOSTICA公司ELISA试剂盒说明书进行。
2.4.5恩诺沙星的确认方法按农业部2003年236号公告高效液相色谱法进行。

2. 5蛋白芯片试剂盒实用性评价

3．讨论和结论
    3. 1　从表 1中可以看出,蛋白芯片试剂盒的灵敏度完全可以满足国家残控计划中所规定的上述四种兽药残留检测方法的要求。
    3.2 从表2边精密度实验结果来看，蛋白芯片试剂盒的有比较好的重现性和稳定性。
    3. 3　在表3中除链霉素与其两种结构类似的同系物硫酸链霉素、双氢链霉素有较强的交叉反应之外,其他药物的交叉反应都很低,证明蛋白芯片试剂盒的特异性较好.
    3. 4从表5显示,在对三种兽药144份样品的检测中, 从芯片法与对比方法的比较中得出：阳性符合率为100%，阴性符合率为96%-100%，证明蛋白芯片试剂盒结果稳定可靠。
    3.5从表6中可以看出，与其他方法相比,蛋白芯片试剂盒具有样品前处理方法简单、速度快,成本低且用同一种方法提取了多种兽药,减少了样品前处理时间。 在一张芯片上可同时检测多种兽药,体现了蛋白芯片高通量的特点。

参考文献

①农业部关于发布《中华人民共和国动物及动物源食品中残留物质监控计划》和《官方取样程序》的通知。（农牧发[1999]8号　2003年7月4日）
②。中国农业部公告第235号动物性食品中兽药最高残留限量。
③中国农业部公告第236号动物性食品中兽药最高残留限量检测方法。
④中国兽药信息网www.ivdc.gov.cn兽药残留检测试剂盒说明书。