脂蛋白涂层毛细管电色谱法的应用

                         尹俊发 宋茂勇 汪海林*
  中国科学院生态环境研究中心环境化学与生态毒理学国家重点实验室 北京 100085

    脂蛋白（lipoprotein）是细胞膜和血液中的一类重要物质，主要由脂质体和载脂蛋白组成，是脂类物质进入血液或细胞的运输形式。本研究将脂蛋白涂层（固定）到毛细管内壁，以期发展一种新的脂蛋白涂层毛细管电色谱（CEC）方法[1]。
    人血浆中有多种脂蛋白，根据结构和密度的差异，可分为乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白 (LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。乳糜微粒和极低密度脂蛋白分别负责转运外源性和内源性脂肪，低密度脂蛋白的主要功能是转运胆固醇，高密度脂蛋白负责转运内源性胆固醇和磷脂。其中，低密度脂蛋白是最受关注的一种脂蛋白。LDL与人的动脉粥状硬化等疾病直接相关，并被发现具有将抗癌药物输送到癌变部位细胞中的功能[2]。
    低密度脂蛋白的结构中富含甘油三酯、胆固醇酯和磷脂等脂质组分（约占70%）和ApoB 100载脂蛋白（约占20%）等成分[3]。通过非共价物理吸附和共价键合两种途径可将LDL固定到毛细管内壁。由于LDL的pI约为5.5，涂层毛细管在pH 4.6和7.4处产生不同方向的电渗流（EOF）。在生理条件下（pH 7.4），EOF为1.45 × 10-4 cm/Vs，对未涂层毛细管的EOF抑制率约为65-70%。
    LDL涂层毛细管首先被用于碱性蛋白质的分离。实验发现，在施加正向电压时，RNase A和α-Chy A的迁移时间落后于EOF，由此推断脂蛋白涂层和碱性蛋白质之间可能存在静电吸引和疏水相互作用。在运行缓冲液中添加2 - 5 mM的MgCl2可消除静电吸引作用，改善分离效率（图1）。疏水作用通过在电泳缓冲液中添加1 - 5%的甲醇加以验证。发现随着甲醇含量的增加，各蛋白质的迁移时间显著缩短（图2）；但与此同时LDL涂层也受到一定程度的破坏。
    实验对电泳缓冲液、添加剂和分离电压等条件进行了优化。在选定的CEC条件下，溶菌酶（Lys）、细胞色素c（Cyt c）、核糖核酸酶A（RNase A）和α-糜蛋白酶原A（α-Chy A）的理论塔板数分别达到130 000、265 000、125 000和88 000块/米。LDL涂层在14天内保持稳定，蛋白质分离的日内精密度RSD < 4 %，日间精密度RSD < 6 %。四种蛋白质的回收率为79-98%，表明这种生物相容性良好的涂层可有效抑制碱性蛋白的吸附。与非共价LDL涂层毛细管比较，共价键合的LDL永久性涂层更为稳定。
    除用于蛋白质分离之外，脂蛋白毛细管电色谱法预期还将在其它方面的研究中具有应用前景：（1）脂肪、胆固醇、磷脂等物质的体内运输过程的研究；（2）脂蛋白与动脉粥状硬化等疾病的关系研究；（3）抗癌药物的体内运输；以及（4）环境致癌物质在体内输运过程的研究等。

参考文献
[1] R. Kuldvee, S.K.Wiedemer, K. Oorni, M.-L. Riekkola, Anal. Chem. 2005, 77, 3401.
[2] S .Hayavi, G.W. Halbert, Biotechnol. Prog. 2005, 21, 1262.
[3] H. Esterbauer, M. Dieber-Rotheneder, G. Waeg, G. Striegl, G. Jurgens, Chem. Res. Toxicol. 1990, 3, 78.