库仑阵列电化学高效液相色谱仪使用的影响因素
                   闫彦芳 张壮 高永红 聂波 王硕仁
         中医内科学教育部重点实验室，北京中医药大学，北京100700

摘要：在新近开始使用HPLC-ECD的过程中，难免碰到各种的问题，本文结合自己的使用经验，从仪器系统各组成部分、色谱柱以及流动相等几个方面，探讨影响该设备正常使用的因素、常见故障成因及解决方法。
关键词：HPLC-ECD，故障排除，使用经验，实验影响因素

    库仑阵列电化学高效液相色谱仪（HPLC-ECD）已应用广泛于神经生理、药理学、临床诊断、中药现代化研究、抗衰老相关研究、天然产物及食品科学、化妆品研制，是近年来分析实验室新购较多的重要设备。该仪器由于自身结构和检测方法学特点使其在应用中难免出现各种各样的问题，维护费用昂贵，并且经常直接影响到检测的准确性和仪器的正常工作。本文结合本实验室的使用经验，从以下几个方面说明其使用和维护中需注意的若干问题。
1. 正确使用与维护
1.1 HPLC-ECD系统由库仑阵列电化学检测器和高效液相色谱仪这两大部分组成，故凡适用于高效液相色谱仪的正确使用与维护注意事项都适用于本仪器。由于库仑阵列电化学高效液相色谱仪的自身使用特点，建议加装带有稳压器的大功率不间断电源系统，蓄电池须半年放电一次，保护电池使用寿命，但每次放电不要放干净，留有一定电量，以保证系统的启动。
1.2仪器放置环境条件：环境条件改变有时对实验结果影响显著。房间须双层玻璃，有向外通风装置，防尘。房间应有遮挡紫外线的窗帘等避光措施，以避免有些待测物见光分解或降解。房间应配备冷暖空调、温度、湿度计，以保持室温在20-25℃、相对湿度30%-70%适宜。
1.3开机维护：开机前，检查流动相、色谱住、电源线路连接是否正确，先开稳压电源，再开输液泵，甲醇：水（20：80）高速冲洗输液泵3分钟，排出气泡；冲洗系统30min，更换实验用流动相 30-45 min，设定流速应从小到大缓慢增加，先打开系统控制电脑、自动进样器、柱温箱设置参数并执行，观察柱压与流速是否相对应的平稳上升，待流速、系统压强稳定后，再打开检测器设置检测参数并执行。必须注意在使用甲醇-水、乙腈-水等无盐流动相时绝对禁止打开库仑阵列电化学检测器执行检测电压，否则昂贵的检测器电极将烧毁报废。
1.4柱前维护：由于待测样本多为血样、组织样本，对样本的预处理应尽可能多地除去杂质和干扰物质。
1.5关机维护：检测实验完毕，执行自动进样器冲洗后，用电脑控制程序先后关闭检测器、柱温箱、自动进样器，电脑及打印机可脱机处理数据。更换流动相为甲醇：水（20：80），开启输液泵控制流动相，高流量冲洗泵系统3分钟，再用甲醇：水（20：80）0.8-1.2 mL/min冲洗系统30-45min，即可关闭输液泵，至柱压为零，关闭泵。如果两周内不使用该仪器，则甲醇：水（50：50）0.8-1.2 mL/min冲洗系统30-45min，最后用纯甲醇0.8-1.2 mL/min冲洗30-45min。
1.3仪器各部件维护
1.3.1 输液泵：仪器设置的流速范围是0.001～9.999mL/min，从系统压强和分离效果出发，一般实验时选择流速0.8～1.2 mL/min。每次开机时以甲醇：水（20：80），高速冲洗输液泵3分钟，排出气泡、冲洗可能的盐结晶。每次关机时亦须以甲醇：水（20：80），高速冲洗输液泵3分钟，冲洗可能的盐结晶。
13.2 系统流路：系统压强和柱压最好要维持在200bar以下，原因是该仪器由于流动相原因不能使用金属管（如使用金属管需经常钝化），系统整个管路由Peek材料管连接，而Peek管不耐高压，当系统压强200bar以上，该管路的各个部位均易出现漏夜情况，渗液少时不易发现，但影响系统压强和检测样品的保留时间会延长，可以拿一小张滤纸，在各接口处，擦拭检测便可看出有无渗液。在Peek材料管打弯处，系统压强、柱压高时经常会出现管壁穿孔漏夜，因此更换Peek材料管时打弯处弧度要大一些，否则易出现穿孔漏夜。
    查明系统压强明显升高的原因，可采用分段检查法，依次卸下色谱柱、色谱柱前保护柱、自动进样器前预柱，开泵，检查管路压强。
    引起柱显著压升高的主要原因有二，一是保护柱中黑、白滤膜的堵塞，液体进色谱柱保护柱前为白滤膜，液体进自动进样器前为黑滤膜，解决办法：（1）每天开机PURGE冲洗泵系统前，包括洗针液所用的甲醇：水（20：80），都要用0.22µm滤膜过滤，1周更换1次。（2）所用水必须为双蒸水。（3）所有配制流动项的试剂均须色谱纯，以降低基线噪音，提高灵敏度，且不易堵塞滤膜。（4）卸下保护柱，断开流路，甲醇：水（20：80），反冲滤膜，如系统压强下降不明显则更换新的滤膜。二是流路中盐结晶的解决办法：采用分段检查法，查出阻塞处后，断开流路，双蒸水冲洗，流速应从小到大缓慢增加，待系统压强下降稳定后，逐渐加大流速，连接系统流路，再以甲醇：水（20：80）冲洗至系统压强稳定在正常水平。
    如系统流路是普通不锈钢管路，则断开分离柱和检测器流路，其余管路系统短接，并用6mol/L硝酸溶液冲洗、钝化，但注意绝对不能用硝酸清洗电极。
1.3.2 自动进样器：（1）使用之前和之后都要清洗1遍自动进样针，如清洗不彻底，则会被阻塞，如进样针阻塞则卸下超声法反复清洗，如仍阻塞则更换进样针。（2）把样品放入样品转盘池时，必须放正，并且样品池盖必须合槽，否则极易损坏进样针。（3）从自动进样器的可靠性和稳定性考虑，并不建议在无人监管情况下，长期过夜使用自动进样器。
1.3.3元件组织箱（柱温箱）： 温度设置后，等待自动升温到设置温度，并且系统压强平衡后，再打开监测器进行检测。柱温箱温度设置不应超过45℃。
1.3.4 电化学检测器及控制、采集软件：本系统建议配备大功率不间断电源并带有稳压器，避免突然断电或电压不稳引起的仪器受损，如果长期不用，则关闭不间断电源，使之自动放电。
（2）流动相的离子摩尔浓度须根据实验要求确定，一般选择范围20-100mM，使用无盐的流动相只能用于冲洗系统，严禁施加检测电势，当施加检测电势时，不允许停泵15分钟以上，可保持低流速，总之要确保足够的流动相流速以进行分析或过夜，否则会烧毁检测电极。
（3）HPLC各部件清洗过程，要关闭电势、断开电池。如要冲洗色谱柱，必须断开柱子后端的连接，冲洗液用烧杯接住，不使其进入检测器。
（4）在满足实验需要的基础上，为了延长电极的寿命，如能以较低电势来检测，尽量就不选择较高的电势。不必每次实验都进行高电势（1000mV）清洗电极程序，一般可在多次实验后清洗电极1次；或当流动相平衡时见基线不断向上漂移时清洗电极1次即可。
（5）使用库仑电极电势绝对不要超过该仪器规定的最大限值。
1.3.5系统控制电脑及打印机： 该仪器配备的电脑及打印机须为专用，不用做其它的文件处理，确保不染病毒。系统程序重新安装一遍是很麻烦的一件事。并且每天每一批数据采集、处理完成后，需要以移动硬盘或光盘拷贝一份备份数据保存起来。