色谱保留时间辅助质谱鉴定中保留时间的标准化

                              杨瑞丰 张正国
      中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 北京 100005

背景：
随着蛋白质组学的迅速发展，液相色谱串联质谱联用（LC-MS/MS）在蛋白质组分析中得到了普遍的应用。为了提高质谱的鉴定能力，越来越多的研究者采用色谱保留时间信息辅助蛋白质的质谱鉴定[1][2]。对于特定的色谱系统，如果对柱长、内径、填料和流动相的组成进行标准化，则同一多肽的色谱保留时间就会相对稳定。利用实验色谱保留时间的这种稳定性，可以辅助利用质谱鉴定蛋白质。但是对于复杂的样品，色谱分离过程中保留时间的稳定性会有所降低，本实验对液相色谱串联质谱联用中的简单样品和复杂样品的色谱保留时间标准化问题进行了研究。

方法：
本实验分别分析了一种简单样品和一种复杂样品的色谱保留时间。简单样品是采用已知的18种蛋白质混合物经100mm×0.1mm的反向柱进行分离，洗脱梯度为10%-35%，洗脱时间为60分钟，然后再使用串联质谱分析取得数据集。复杂样品是采用正常人尿液蛋白质经强阳离子交换柱（150mm×320µm）和反向色谱柱（150mm×170µm），强阳离子柱的乙酸胺洗脱浓度分别为0mM，25mM，50mM，75mM，100mM，125mM，150mM，250mM，500mM和1M，反相柱洗脱梯度为5%-30%，洗脱时间为3小时。然后同样使用串联质谱分析取得数据集。本实验使用SEQUEST（Bioworks3.1）软件对质谱时间数据集进行数据库检索，并以单次鉴定的多肽为基准点拟合曲线。然后，对多次鉴定到的多肽的离子峰进行峰重建，并提取出该多肽的峰，则该峰对应的时间就是该多肽的保留时间。最后，对不同的实验中鉴定到的相同多肽的保留时间用上述拟合曲线进行标准化。

结果及讨论：
通过对简单样品数据集的分析显示多肽保留时间的重复性较好。鉴定多肽的标准差均小于1%，各实验之间的相关系数R2达到0.988，标准化后保留时间的标准差和相关系数都提高不大。通过对复杂样品数据集的分析显示保留时间的重复性较差。鉴定多肽的标准差大于2%，各实验之间的相关系数R2为0.953。对保留时间标准化后，鉴定多肽的标准差降低到0.5%以下，各实验之间的相关系数R2达到0.980。

参考文献
1. Shen Y, Kim J, Strittmatter EF, et al. Characterization of the human blood plasma proteome. Proteomics, 2005, 5(15): 4034-4045.
2. Kawakami T, Tateishi K, Yamano Y, et al. Protein identification from product ion spectra of peptides validated by correlation between measured and predicted elution time in liquid chromatography/mass spectrometry. Proteomics, 2005, 5(4): 856-864.